آنزیم های منعقد کننده شیر

چکیده:

آنزیم های انعقادی شیر از منابع مختلفی تهیه می شوند که مهمترین و قدیمی ترین آن مایه پنیر (رنت) می باشد که با منشا حیوانی است . اما به دلیل کاهش میزان تولید آن سعی شده از جایگزین های میکروبی ٬گیاهی و طیور استفاده شود . که این جایگزین ها باید دارای پروتئاز اسیدی باشند .

در شیرخام پروتئاز هایی نیز حضور دارند که دارای فعالیت آنزیمی پایینی هستند که البته در انعقاد نقشی ندارند زیرا سبب هیدرولیز Bکازئین به گاما کازئین می شوند . اما برخی باکتری های گرم منفی سایکروتروف گونه هایی از سودوموناس ٬ آلکالیجنس و فلاوو باکترییوم در شیر خام حضور دارند که با پروتئاز های خود سبب هیدرولیز کازئین به ترکیبات پارا کاپا کازئین مانند و انعقاد می شوند.

اساس انعقاد آنزیمی شیر به حساسیت کاپا کازئین و حضور یون کلسیم بستگی دارد .پس از شکسته شدن کاپا کازئین در حضور آنزیم و به هم ریختن ساختار آن میسل ها تجمع کرده ودر هم فرو می روند و تشکیل دلمه می دهند و انعقاد رخ می دهد.

1– مقدمه و اهمیت موضوع
انعقاد شیر عبارت از تجمع میسلهای آن به صورت یک شبکه است.این شبکه نمایانگر فاز جامد می باشد
وگلبولهای چربی در آن محصور می شوند .شیر در روشهای متداول پنیر سازی٬ با افزودن آنزیم های ویژه ای دلمه می شود. ماده پروتئینی عمده شیر موسوم به کازئینوژن به صورت لخته تشکیل می گردد . انعقاد شیر به صورت پنیر به وسیله ی عمل اسید حاصل از تخمیر لاکتوز به واسطه ی باکتری ها یا به وسیله مایه پنیر به دست آمده از معده چهارم نشخوارکنندگان شیر خوار و یا هر دو توأم با یکدیگر صورت می گیرد . اثر منعقد کننده ی پنیر مایه مربوط به آنزیم رنین است که پروتئین شیر را منعقد می کند و آن را به صورت لخته می سازد . در غالب موارد با این که برای انعقاد شیر مایه پنیر به کار می برند ، مقداری باکتری نیز به منظور تولید اسید و کمک به تشکیل لخته ي پنیر اضافه می کنند ، به علاوه از باکتری های تولید کننده بوی خوش و یا باکتری های تولید کننده گاز نیز استفاده می شود .پروتئازها نسبت به آنزیم های دیگر برای کنترل انعقاد شیر ترجیح داده می شوند. پروتئازهای موجود در پنیر مایه که در انعقاد شیر دخیل می باشند وباعث تشکیل لخته در پنیر سازی می شوند
شامل:کیموزین٬پپسین وپروتئازهای میکروبی بوده و عموما برای تولید پنیرهای مختلف کاربرد دارند.
میزان کیموزین تحت تاثیر تغذیه دام قرار می گیرد.میزان کیموزین از عصاره استخراج شده 75 تا 100 درصد متغیر می باشد وهمچنین میزان پپسین از عصاره استخراج شده حداقل 30 درصد می باشد لذا رنت شامل دو ترکیب کیموزین وپپسین می باشدکه در گوساله تازه متولد شده (calf) نسبت کیموزین به پپسین 95 درصد به5درصد می باشد .

2– آنزیم های منعقد کننده شیر:

2-1-آنزیم های حیوانی مانند: رنین٬کیموزین٬پپسین٬تریپسین٬کیموتریپسین
2-2-آنزیم های گیاهی مانند: پاپائین٬فیسین٬بروملین
2-3-آنزیم های میکروبی مانند: باکتریها و قارچ های سنتز کننده آنزیم
2-4-پروتئازهای طبیعی شیر ( قلیایی یا پلاسمی – اسیدی (

2-1-آنزیم های حیوانی:

2-1-1-رنین (Rennin) :(2)شکل خالص آنزیم موجود در رنت (Rennet) یا مایه پنیر است که در پنیر سازی از آن استفاده می شود همانطور که اشاره شد این آنزیم از معده چهارم گوساله شیر خوار استخراج می گردد. پس از اینکه گوساله شروع به مصرف علف می کند به جای رنین پپسین ترشح می شود.در روش سنتی شیردان یا معده چهارم گوساله جوان را خشک کرده ونمک می زنند و سپس آن را به ذرات کوچک بریده و عصاره آنزیمی را به وسیله محلول نمک 10درصد استخراج کرده و سپس با اضافه کردن اسید٬PH آن را تنظیم کرده و سپس با افزودن نمک(16-20درصد) و مواد نگهدارنده٬ رنین را صاف می کنند.اغلب کارامل برای استاندارد کردن رنگ و گهگاهی نیز مواد طعم دهنده برای پوشش بوهای تند حاصل از معده استفاده می شود. این آنزیم به صورت پودرهای هیدراته٬ گرانول و یا مایع عرضه می شود.
مکانیزم عمل رنین:

این آنزیم به حالت غیر فعال به نام پرورنین(Prorennin) ترشح می گردد.ماده استخراج شده از معده خشک شده ٬ هم دارای رنین وهم دارای پرو رنین می باشد.تبدیل پرورنین به رنین با افزودن اسید تسریع می گردد.این فرایند به صورت اتوکاتالیتیک است٬یعنی با تولید مقداری رنین ٬این ماد ه بقیه پرورنین را به رنین فعال تبدیل می کند.پپسین نیز می تواند کار تبدیل پرورنین به رنین را انجام دهد.عمل تبدیل پرورنین به رنین همراه با آزاد شدن پپتیدهایی از قسمت انتهای N ملکول پرورنین می باشد که طی آن وزن مولکولی از 36000 به 31000 کاهش می یابد.سه پیوند دی سولفید قسمتهای مختلف پرورنین را به هم متصل می کنند که بعد از تبدیل به رنین نیز بدون تغییر باقی می مانند.PH مناسب برای فعالیت رنین 3.5 است اما بیشترین پایداری آن در PH =5 مشاهده میشود.

2-1-2- کیموزین:حساسیت به هیدرولیز در حضور آنزیم کیموزین یا لخته دادن به وسیله کلسیم از جمله خواص کازئین به شمار می رود.کیموزین به باند پپتیدی بین فنیل آلانین 105 ومتیونین 106 واقع در کاپا کازئین به سرعت حمله ور شده ٬ آن راهیدرولیز می کند در نتیجه کاپا کازئین قدرت تثبیت کنندگی خود را در قبال ممانعت ازرسوب میسلهای کازئین از دست داده ٬ میسلها در حضور کلسیم متراکم می شوند .
کیموزین از منابع میکروبی نیز به دست می آید. کیموزین استحصالی از اشرشیاکلای در سال 1990 میلادی در آمریکا مهمترین نوع مایه پنیر محسوب می شده است.همچنین کیموزین استحصالی ازKluyeromyces lactic  در بعضی از کشور های اروپایی نظیر آلمان ٬دانمارک ٬پرتقال برای پنیرسازی استفاده می شود.

2-1-3-پپسین:
این آنزیم به صورت غیر فعال موسوم به پپسینوژن در مخاط پوششی سطح معده تولید می گردد که در PH پایین معده با جداشدن پپتید های کوچک از قسمت انتهای Nمولکول به پپسین فعال تبدیل می گردد. پپسین از321 اسید آمینه تشکیل شده است .پپسین در PH بیشتر از 5 دناتوره می شود وفعالیت خود را از دست می دهد.این آنزیم ترجیها اتصالات مجاور فنیل آلانین٬تیروزین وتریپتوفان را می شکند.این پروتئاز که در PH پایین واسیدی عمل می کند در تولید پنیر استفاده می شود اما کیفیت پنیر تولیدی به خوبی پنیر تولید شده توسط رنین نیست چراکه امکان تولید پپتید های تلخ مزه وجود دارد.تلخی حاصله را می توان با به کار گیری کربن فعال٬آنزیم کربوکسی پپتیداز A و یا اولترافیلتراسیون کاهش داد و یا حذف نمود .پپسین طیور: پپسین طیور می تواند پروتئین شیر را در PH اسیذی منعقد نماید. چنانچه میزان کشتار طیور در کشتارگاه ها خیلی زیاد باشد جایگزینی پپسین طیور به جای مایه پنیر رنین مقرون به صرفه است.

2-1-4-ترپسین و کیمو تریپسین :
این دو آنزیم از پانکراس در روده ترشح می شوند .تریپسین پیوند پپتیدی تشکیل شده توسط گروه کربوکسیل اسید آمینه لیزین یا آرژنین با سایر اسیدهای آمینه را می شکند . کیمو تریپسین در واقع شامل چندین نوع آنزیم شبیه به هم است که با پیشوند آلفا٬ بتا٬ گاما٬ دلتا وپی مشخص می شوند.اینها پیوند مجاور اسید های آمینه تیروزین ٬فنیل آلانین و تریپتوفان را می شکنند وPH مناسب برای فعالیت آنها حدود8 است.

2-2-آنزیم های گیاهی:
این آنزیم ها دارای ریشه گیاهی هستند. محل فعال این آنزیمها دارای یک سیستئین ویک هیستیدین است که برای فعالیت آنها ضروری می باشد.
به عنوان مثال پرتئازهای گیاهی به کار گرفته شده برای تولید پنیر در نواحی مختلف جهان شامل پاپائین ٬بروملین ٬فیسین٬ اوریزاسین (Oryzasin) از گیاه (Oriza sativa)٬ کاکامیسین (Cucumisin) از (Cucumis melo ssp) ٬پروتئاز سیب فاسد شده از(Calotropis)  و پروتئاز کاهو از(Lactuca sativa) استحصال می شود. (8) دانه گیاه علفی Solanum dubium fresen که بومی سودان است٬ توانایی انعقاد شیر را به خاطر حضور پروتئاز های سرینی پایدار دارد.

2-2-1-فیسین: فیسین (Ficin) از شیره سفیدرنگ یا لاتکس درخت انجیر(Ficus Carica) تهیه می شو. فیسین می تواند پروتئین های شیر رادر PH7 الی 8 کواگوله نماید.

2-2-2-پاپائین:پاپائین (Papain)که از خربزه درختی (Carica Papaya) که ٬کاملا رسیده نباشد ٬به دست می آید . این آنزیم در PH 7-4 ودرجه حرارت 70-40 درجه سانتیگراد فعال می باشد.

2-2-3-بروملین:بروملین (Bromelain) که از آناناس (Ananas Comosus) استحصال می شود . قدرت انعقادی این مایه پنیر در مقایسه با فیسین و پاپائین بسیار ناچیز است.

2-2-4-معایب آنزیم های گیاهی منعقد کننده شیر:

_ در پنیر تولید شده توسط این نوع از آنزیم ها طعم ومزه تلخ ایجاد می شود. (آمونیاک)NH3→ اسید آمینه→ مایه پنیر گیاهی → پپتید در شیر

_ راندمان تولید پنیر در مقایسه با مایه پنیر حیوانی کاهش می یابد.

– کیفیت پنیر تولید شده از لحاظ ارگانولپتیکی کاهش می یابد.

2-3-آنزیم های میکروبی:
مایه پنیر های میکروبی (microbial rennet) پس از جنگ جها نی دوم مصرف آن در پنیر سازی به سرعت افزایش یافته که از قارچ های Mucor Miehei وMucor Pusilus و Endothia parasitica استخراج و به صورت تجارتی عرضه می شوند.
آنزیم های میکروبی انعقاد شیر به طور مطلوب جایگزین مایه پنیر های حیوانی در صنعت پنیر سازی شده اند. آسپرژیلوس اوریزه  (Aspergillus oryzae)  از بین 16 نژاد قارچ برای تولید بیشترین فعالیت انعقادی شیر٬ انتخاب شده است .
از باکتری های تولید کننده آنزیم های منعقد کننده شیر می توان به استرپتوکوکسی های مزوفیل٬ نظیر استرپتوکوکوس لاکتیس و استرپتوکوکوس کرموریس اشاره کرد .اما به دلیل خاصیت پروتئولیتیکی نسبتا پایین اینها ٬توصیه می شود از استرپتوکوکوس فکالیس و استرپتوکوکوس دورانس استفاده شود. همچنین از محیط کشتهای ویژه ای بدین منظور استفاده می شود مثلا فعالیت قابل توجه آنزیم حاصل از باسیلوس سوبتیلیس زمانی فراهم می شود که باکتری در محیط کشتی با پایه نمکی در PH=6 و درجه حرارت 37 درجه سانتیگراد با شیک کردن rpm 175 در طی یک روز ٬ کشت داده شود .
این باکتری ها در مقایسه با استرپتوکوکسی های لاکتیس و کرموریس ٬ از حداکثر دمای رشد بالاتری برخوردارمی باشند (بیش از 45 درجه سانتیگراد).
٭از آنجایی که کپک ها ٬ خصوصا سویه های پنی سیلیوم در تولید پنیر آبی و انواعی که کپکها در سطح آنها رشد می کنند به کار می روند ٬ این سئوال مطرح می گردد که آیا در این پنیر ها مایکو توکسین تولید می شود یا نه؟

1. غلظت 0.05 تا 6ppm آلکالوئید را کوفورتین در پنیر آبی برای ایجاد مسمومیت ٬ بسیار پایین می باشد.

2.توکسین توسط تعداد اندکی از سویه های پنی سیلیوم راکوفورتی وآن هم در محیط کشت های مصنوعی تشکیل می شود . بنابراین ٬ ترکیب فوق٬ به هیچ وجه در پنیر یافت نمی شود .

3. توکسین (پاتولین ) که ماده ای سرطان زا در موشهاست ٬توسط آن دسته از سویه های پنی سیلیوم راکوفورتی که در پنیر سازی به کار برده می شوند ٬تولید نمی گردد.

2-4- پروتئازهای طبیعی شیر:
آنزیم های طبیعی یا به طور طبیعی در شیر خام وجود دارندیا از برخی از باکتری های سرمادوست که به میزان زیادی پروتئینازهای فعال تولید می کنند ناشی می شود . Auclair و Lenoir در سال 1980 خاطر نشان کردند که سرد مردن شیر خام سبب انتقال پروتئیناز قلیایی ( پلاسمین) از فاز کلوئیدی به فاز سرمی می شود. بتا کازئین در دمای پایین ممکن است به دو جزء گاما کازئین و پروتئوزپپتون هیدرولیز شود این دو بعد ها در حضور پروتئینازهای دیگر به پپتیدهای تلخ تبدیل شده مزه ای تلخ به شیر می دهند در نتیجه راندمان پنیر در اثر این تبدیل پایین می آید .(3)

3-مکانیزم انعقاد به وسیله مایه پنیر:
3-1-کازئین:کازئین شیر حدود 75تا85 درصد پروتئین شیر را کازئین تشکیل می دهد .معمولا کازئین به صورت خالص درشیر موجود نیست بلکه ابتدا به صورت کازئینات کلسیم است و سپس با جذب فسفات کلسیم فسفو کازئینات کلسیم تشکیل می شود که شبیه دانه های تمشک است در پروتئین کازئین حدود 20 اسید آمینه شرکت دارند .اندازه کازئین حدود 20-10 میلی میکرون است و حرارت های پایین اصولا تاثیری روی کازئین ندارد حرارت از 130 درجه سلسیوس بالاتر روی کازئین اثر می گذارد و ممکن است تغییراتی در بافت پروتئینی کازئین به وجود آورد کازئین به 4 قسمت تقسیم می شود ( آلفا1،آلفا2) ،بتا، کاپا و گاما که به نسبت های متفاوتی در کازئین شیر وجود دارند کاپا کازئین را فاکتور پایدار کننده (STABILIZING FACTOR) گویند ،زیرا موجب می شود میسل ها در شیر به صورت معلق درآیند و رسوب نکنند ،اگر کاپا کازئین را جدا کنند حالت پایدار از بین می رود وپروتئین کازئین در کنار یون کلسیم رسوب می کند ماده ای به نام رنین می تواند کاپا کازئین را از شیر بیرون بکشد ،اگر یون کلسیم در شیر نباشد حتی اگر کاپا کازئین بیرون کشیده شود رسوب نمی کند. 10-7درصد رنین داخل شیر می ریزند وتا دمای 50-42 درجه سلسیوس حرارت میدهند شیر رسوب میکند (لخته رنینی تشکیل می شود) ،انعقاد شیر توسط اسید هم انجام می شود PHشیر 6/6-4/6 است لخته ای که توسط اسید به وجود می آید اسید –کازئین ولخته ای که توسط رنین به وجود می آید رنین –کازئین است لخته رنین-کازئین بهتر است چون کلسیم و فسفر بالاتری نسبت به لخته اسید-کازئین دارد بهترین اسید برای ایجاد لخته ،لاکتیک اسید است) در مورد رنین برای ایجاد لخته حتما یون کلسیم را نیاز داریم ولی در مورد اسید یون کلسیم را نیاز نداریم (از آبلیمو ،سرکه و…) نیز می توان استفاده پس از جداشدن کازئین آنچه می ماند آب پنیر است (whey protein)این مایع که پس از رسوب دادن کازئین و صاف کردن آن به دست می آید حاوی گلوبولین ها ،لاکتو فرینها ،سرولو آلبومین ،ایمیونوگلوبین ها ،پروتئو پپتو فرکشن ولاکتو فرین می باشد لاکتوفرین از پروتئین های آهن دار است پروتئین های بالا برخلاف کازئین به حرارت حساسند و اگر دما از 60 درجه سلسیوس بالاتر رود رسوب می کنند ولی در مقابل اسید و رنین مقاومند.

3-2-انعقاد شیر توسط مایه پنیر در دو مرحله انجام می شود:
در مرحله اول که آنزیمی است آنزیم روی کاپا- کازئین که دارای 169 اسید آمینه می باشد اثر می کند و پیوند میان فنیل آلانین و متیونین را که به ترتیب اسیدهای آمینه شماره 105 و 106 در این پروتئین هستند می شکند در نتیجه کاپا- کازئین به دو بخش کازئینو- ماکرو پپتید محلول و پارا کاپا کازئین نامحلول شکسته می شود .به دنبال این اثر حفاظت کننده کاپا – کازیین روی s α- کازئین ازبین می رود. این واکنش آنزیمی حتی ممکن است در درجه حرارت 5درجه سانتیگراد نیز اتفاق افتد. در مرحله دوم که غیر آنزیمی است٬کازئین تغییر یافته تحت اثر یون کلسیم رسوب می کند.سایر آنزیم های تجزیه کننده پروتئین٬نظیر پپسین و پروتئازهای میکروبی نیز می توانند همان پیوند ذکر شده را بشکنند.
انعقاد شیر با افزودن آنزیم های منعقد کننده٬ تنها در حضور یون کلسیم عملی می گردد.

5-نتیجه گیری:

٭تفاوت کلی بین آنزیم های حیوانی و گیاهی منعقد کننده شیر اینست که مایه پنیر های حیوانی حاوی 8- 4 درصد پروتئازهای فعال و ناخالصی هایی نظیر ماده لزج و نمک می باشد. اما مایه پنیر های میکروبی حاوی 80- 90 درصد پروتئاز فعال است.
٭عصاره های گیاهی در مقادیر زیاد سبب پروتئولیز شدید و ایجاد طعم تلخ می شوند ولی مقادیر پایین آن محصولی با کیفیت بالا می دهد .٭ منعقده کنندهای گیاهی در مقایسه با کیموزین زمان تشکیل ژل کوتاهتری دارند.

* فعالیت ضعیف پروتئیناز در شیر پاستوریزه یا پنیر عملا هیچ اهمیتی ندارد ٬ با این وجود نگهداری شیرUHT به مدت طولانی در دمای اتاق منجر به آن می شود که آنزیم فوق محصول را لخته و طعم تلخی به آن می دهد.

فهرست منابع:

1.ضیابری م.1383.تکنولوژی شیر وفرآورده های آن.نشر علوم کشاورزی.چاپ پنجم.
2.فاطمی ح.1387.شیمی مواد غذایی.شرکت سهامی انتشار.چاپ هفتم(276-275)
3.مرتضوی ع.قدس روحانی م.جوینده ح.1380.تکنولوژی شیروفرآورده های لبنی.انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد.چاپ پنجم .(ش ص 60)و (ش ص 36-33)و (ش ص 123)
4.منطقی ع.1387.کاربرد آنزیم ها در پنیرسازی.مقاله.شرکت صنایع شیر ایران(پگاه(
5.مفاخری س.1385.(میکروبیولوژی صنعتی.
6.سید مصطفی رضازاده .کازئین. 

7.Isam A.A.M٫ I.Morishima٫E. E.Babiker٫N. Mori .2009.Dubiumin ٫ a chymotrypsin- like serine protease from the seeds of Solanum dubium Fresen .70(4)٫PP:483-491

8.Rodrigues durte.A٫ D. Rodrigues durte٫K. Aparecida Moreira٫M.Taciana Holanda Cavalcanti٫J.Luiz de lima- filho٫A.Lucia figueiredo porto.2009.Jacaratia corumbensis o.Kuntze a new vegetable source for milk-clotting enzymes.

9. shieh C.J٫L. Phan Thi and I-L. shih.2008.Milk- clotting enzymes prouduced by culture of Bacillus subtilis natto.

10.Bornaz.S ٫ N. Guizani ٫ N.Fellah ٫ A.Sahdi. ٫ M.B.Slama ٫ H.Attia.H.2010. Effect of Plant Originated Coagulants and chymosin on Ovin Milk Coagolation.13(1) . PP: 10-12

 

 

تهیه و تنظیم : ریحانه صادقی  – فاطمه معبودی  – سیده آمنه موسوی

بازدیدها: 6