کروماتوگرافي به عنوان يکي از روشهاي آزمايشيِ کارآمد در نانو فناوري، شامل چند روش است: کروماتوگرافي کاغذي، کروماتوگرافي ژلي و کروماتوگرافي گازي از جمله روشهايي هستند که در اينجا با آنها آشنا ميشويم. دقت کنيد که زمان، عامل کنترل ما بر انتخاب ذراتي است که با سرعتهاي مختلف در محيط کروماتوگرافي توزيع مکاني مييابند.
اولين روشهاي کروماتوگرافي در سال ۱۹۰۳ توسط ميخائيل سوئت ابداع و نامگذاري شد. او از اين روش براي جداسازي مواد رنگي استفاده کرد.ريچارد لارنس و جان آرچر در سال ۱۹۵۲ به پاس اکتشافاتشان در زمينة کروماتوگرافي جايزة نوبل گرفتند. توصيف کروماتوگرافي
کروماتوگرافي را به علت اينکه دربرگيرندة سيستمها و تکنيکهاي مختلفي است نميتوان به طور مشخص تعريف کرد. اغلب جداسازيها بر مبناي کروماتوگرافي و بر روي مخلوطهايي از مواد بيرنگ از جمله گازها صورت ميگيرد.
کروماتوگرافي متکي بر حرکت نسبي دو فاز است. يکي از اين فازها بدون حرکت است و فاز ساکن ناميده ميشود و ديگري را فاز متحرک مينامند. اجزاي يک مخلوط به وسيلة جرياني از يک فاز متحرک از داخل فاز ساکن عبور داده ميشوند و جداسازي بر اختلاف در سرعت مهاجرت اجزاي مختلف نمونه استواراست.
مثال
اگر به طور ساده بخواهيم عمل کروماتوگرافي را انجام دهيم، يک ليوان حاوي آب را برميداريم و يک قطره جوهر در آن ميچکانيم. سپس تکهکاغذي را برميداريم و قسمتي از آن را در ليوان آب قرار ميدهيم. پس از مدتي مشاهده ميشود که جوهر از کاغذ بالا ميرود و پخش ميشود.
روشهاي کروماتوگرافي
کروماتوگرافي جذب سطحي
کروماتوگرافي لاية نازک
کروماتوگرافي تبادل يوني
کروماتوگرافي ژلي
کروماتوگرافي گاز ـ جامدکروماتوگرافي مايع ـ مايع
کروماتوگرافي تقسيمي
کروماتوگرافي کاغذيکروماتوگرافي گاز ـ مايع
کروماتوگرافي گاز ـ مايع
کروماتوگرافي ستون موئينمزيت روشهاي کروماتوگرافيروشهاي کروماتوگرافي ميتوانند جداسازيهايي را که به روشهاي ديگر خيلي مشکلاند، به انجام برسانند. زيرا اختلاف جزئي موجود در رفتار جزئي اجسام، در جريان عبور آنها از يک سيستمِ کروماتوگرافي چند برابر ميشود.
هر چه اين اختلاف بيشتر شود، قدرت جداسازي بيشتر و براي انجام جداسازي نياز کمتري به وجود اختلافات ديگر خواهد بود.
مزيت کروماتوگرافي نسبت به ستون تقطير اين است که بهآساني ميتوان به آن دست يافت. با وجود اينکه ممکن است چندين روز طول بکشد تا يک ستون تقطير به حداکثر بازده خود برسد، ولي يک جداسازي کروماتوگرافي ميتواند در عرض چند دقيقه يا چند ساعت انجام گيرد.
يکي از مزاياي برجستة روشهاي کروماتوگرافي اين است که آنها آرام هستند. به اين معني که احتمال تجزية مواد جداشونده به وسيلة اين روشها در مقايسه با ساير روشها کمتر است.
مزيت ديگر روشهاي کروماتوگرافي اين است که تنها مقدار بسيار کمي از مخلوط براي تجزيه لازم است. به اين علت، روشهاي تجزيهاي مربوط به جداسازي کروماتوگرافي ميتوانند در مقياس ميکرو و نيمه ميکرو انجام گيرند.
روشهاي کروماتوگرافي ساده، سريع و وسايل مورد لزوم آنها ارزان هستند. اجزاي مخلوطهاي پيچيده را به کمک اين روشها ميتوان از يکديگر جدا کرد.انواع کروماتوگرافي
مواد شيميايي مشابه کروماتوگرافي تقسيمي
مواد شيميايي غير مشابه کروماتوگرافي جذب سطحي
گازها و اجسام فرّار کروماتوگرافي گازي
مواد يوني و معدني کروماتوگرافي تبادل يوني در ستون
کروماتوگرافي کاغذي يا لايه نازک
مواد يوني و غير يوني الکتروفوز ناحيهاي
مواد زيستي و ترکيباتي با جرم مولکولي نسبي بالا کروماتوگرافي تبادل يون يا ژلي
انواع کروماتوگرافی | مواد |
کروماتوگرافي تقسيمي | مواد شيميايي مشابه |
کروماتوگرافي جذب سطحي | مواد شيميايي غير مشابه |
کروماتوگرافي گازي | گازها و اجسام فرّار |
کروماتوگرافي تبادل يوني در ستون کروماتوگرافي کاغذي يا لايه نازک | مواد يوني و معدني |
الکتروفوز ناحيهاي | مواد يوني و غير يوني |
کروماتوگرافي تبادل يون يا ژلي | مواد زيستي و ترکيباتي با جرم مولکولي نسبي بالا |
بدون شک مهمترین و پرکاربردترین روش جداسازی، روش “کروماتوگرافی” است. کروماتوگرافی (Chromatography)، بوسیله یک گیاه شناس روسی به نام تسوت، در اوایل قرن بیستم (۱۹۰۳) کشف شد. او از این تکنیک برای جداسازی رنگدانه های مختلف گیاهی مانند کلروفیلها و گزانتوفیلها استفاده کرد.
روشهای کروماتوگرافی بر پایه دو مفهوم کلی دسته بندی می شوند: در روش اول، جداسازی بر اساس مفاهیم فیزیکی صورت گرفته و شامل دو گروه کروماتوگرافی ستونی (Column) و کروماتوگرافی سطحی است.
اساس نام گذاری در دسته بندی دوم که مرسوم تر است، نوع فاز متحرک، فاز ساکن و همچنین نوع تعادل ایجاد شده بین دو فاز است. این دسته شامل دو گروه کلی کروماتوگرافی مایع (فاز متحرک مایع می باشد) و کروماتوگرافی گازی (فاز متحرک گاز) است.
۲ مفاهیم کلیدی در کروماتوگرافی
درتمامی روشهای کروماتوگرافی، جداسازی بر پایه تفاوت مقداری آنالیت (ماده مورد جداسازی) در دو فاز ساکن (Stationary Phase) و متحرک (Mobile Phase) انجام می شود . این تفاوت مقدار، در نهایت منجر به تشکیل تعادلی می گردد که آن را با پارامتری به نام ثابت توزیع (K) بیان می کنند. در این رابطه Cm و Cs به ترتیب نشان دهنده غلظت مولی آنالیت در فازمتحرک و فاز ساکن است.

نتایج تحقیقات نشان می دهند که پدیده های فیزیکی و شیمیایی متفاوتی بر روی سرعت جداسازی و همچنین پهنای باند دیده شده برای هر آنالیت تاثیر دارند. از بین تئوری های موجود که به توجیه و محاسبه این عوامل می پردازند، تئوری بشقابک های فرضی (Plates) کاربرد بیشتری دارد. در این تئوری فرض می شود که هرستون از یک سری لایه های باریک، افقی وکاملا مجزا از هم، که به طور متوالی قرار گرفته اند، تشکیل شده است. به هر یک از این لایه ها، بشقابک گفته می شود. در هرکدام از این بشقابکها آنالیت در تعادلی بین فاز متحرک و ساکن قرار دارد و در نهایت با انتقال بین بشقابکها عمل جداسازی صورت می پذیرد. کارایی هر ستون به تعداد بشقابکهای موجود درستون و یا به عبارت دیگر به تعداد تعادل های ایجاد شده در ستون بستگی دارد. بنابراین برای بررسی کارایی ستون تعداد بشقابک های فرض (N)را از رابطه زیرمحاسبه می کنند. در این رابطه H نشان دهنده ی ارتفاع هر بشقابک و L طول ستون را به نمایش می گذارد.

در این مباحث پارامترها و تعاریف مختلف دیگری به منظور محاسبه کارایی ، شرایط آزمایشگاهی و در نهایت اندازه گیری کمی آنالیت وجود دارند. برای اطلاعات بیشتر به منبع شماره ۱ مراجعه شود.] [
۳ کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
از میان تکنیک های جداسازی، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (High Performance Liquid Chromatography -HPLC)، بیشترین رشد و کارایی را داشته است و سالیانه میلیونها دلار صرف خرید و فروش دستگاههای HPLC در دنیا می شود. علت این رشد را می توان به حساسیت بالا، تعیین مقدار کمی با صحت بالا، قابلیت آنالیز نمونه های غیرفرار و حساس به دما که با تکنیکGC (کروماتوگرافی گازی) امکانپذیر نیستند، نسبت داد.
۳-۱ فاز ساکن و فاز متحرک
در مورد قطبیت فازهای ساکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد. طبق این قاعده، قطبیت حل شونده و فاز متحرک باید نزدیک به هم باشد، ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد. ترتیب قطبیت گروههای عاملی در ترکیبات به صورت زیر است:
هیدروکربن < اترها < استرها < کتونها < آلدئیدها < آمیدها < آمینها < الکلها
خصوصیات فاز متحرک در HPLC در زیر آمده است:
• درصد خلوص بالا ( حلالهایی با درصد خلوص بسیار بالا ، HPLC Grade، در بازار موجود است که قیمت بالایی نیز دارد.)
• نقطه جوش بالاتر از دمای ستون ( به خصوص در مواردی که با گرمکن (Oven) کار می شود)
• واکنش پذیری کم (Inertness)
• قابلیت تطابق با آشکارساز
۳-۲ اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه HPLC
دستگاه و تجهیزات HPLC شامل قسمت های مختلفی است که در ادامه به آنها اشاره می شود:
۱- مخازن حلال: که در آنها فاز متحرک و یا حلالهای شستشو دهنده ستون ریخته شده است.
۲- موتور یا پمپ: به منظور انتقال حلال و همچنین نمونه در فضای نسبتا طویل ستون نیاز به ایجاد فشاری در سیستم است که برای ایجاد آن حداقل از یک پمپ یا موتور استفاده می شود. حلال (فاز متحرک) توسط پمپ با سرعت و جریان ثابتی بر روی فاز ساکن حرکت داده می شود. فشار سیستم به اندازه (سایز) ذرات موجود در ستون، گرانروی (Viscosity) و سرعت جریان فاز متحرک بستگی دارد. بسته به نوع جداسازی، میزان سرعت جریان فاز متحرک تعیین می گردد. در مواردی که با تعددی از آنالیتها مواجه هستیم، هر گونه جدا شده خود را به صورت یک پیک در کروماتوگرام نهایی نشان میدهد. در سرعت جریان کمتر فاز متحرک ، فاصله بین پیک ها افزایش یافته و جداسازی بهتری خواهیم داشت. معمولا گفته می شود که در ستون هایی با قطر مرسوم (کمتر از ۵mm) سرعت جریان نباید بالاتر از ۲/۵ ml/min باشد چرا که باعث صدمه زدن به ستون و کاهش عمر مفید آن می شود.
به عنوان فاز متحرک، مخلوطی از حلالها در ازای یک حلال خالص میتواند بهکار گرفته شود. نسبت اجزاء فاز متحرک در طی یک تزریق ممکن است ثابت باشد که در این صورت به آن روش ایزوکراتیک (Isocratic) گفته می شود. در حالتی دیگر که به آن روش گرادیانت ) ( Gradient گفته می شود، طی یک تزریق و با پیشرفت زمان، طبق برنامه ای که از قبل برای سیستم تعریف شده است، درصد متفاوتی از دو یا چند حلال مخلوط شده و در سیستم توسط پمپ جریان می یابد.
۳- تزریق کننده(Injector): تزریق نمونه، بسته به نوع دستگاه، به دو شکل دستی و یا خودکار انجام می گیرد. در روش خودکار، نمونه در ظروف مخصوصی ریخته شده و در محل تعبیه شده در دستگاه قرار می گیرد. پس از اینکه اپراتور دستور تزریق را (از طریق نرم افزار ) می دهد، نمونه توسط یک سرنگ به سیستم منتقل می شود. در روش دستی، از سرنگ هایی با ظرفیت های مختلف برای تزریق نمونه استفاده می شود. حجم نمونه تزریق شده (در هر دو روش)، به حجم حلقه نمونه بردار ( Loop )بستگی دارد و مقدار آن معمولا در حد ۵ تا ۵۰۰ میکرولیتر است. نمونه ابتدا وارد این حلقه شده و پس ازآماده شدن سیستم به همراه فاز متحرک وارد ستون می شود.
۴- ستون: پس از تزریق، نمونه ابتدا وارد قسمتی به نام پیش ستون (pre-column) یا ستون محافظ (Guard column ) می شود. نقش این ستون محافظت از ستون اصلی است. طول این ستون معمولا در حد سانتی متر است و جنس آن از فولاد ضد زنگ است. ماده پرکننده (Packing) ستون محافظ از جنسی مشابه ماده پرکننده ستون اصلی است. هم جنس بودن نوع پرکننده این مزیت را دارد که اگر ماده ای که با ذرات ستون وارد واکنش شود در نمونه موجود باشد، در ابتدا در ستون محافظ به دام افتاده وستون اصلی را دچار آسیب نمی کند. طول ستونهای اصلی دستگاه معمولا حدود ۳۰-۱۰ سانتی متر بوده و درون ستون را با موادی که به یکی از دو فرم پوسته دار و یا متخلخل است، پر کرده اند. سایز این مواد پرکننده که بر کیفیت جداسازی تاثیر فراوانی دارد متفاوت بوده و معمولا در حد ۳ تا ۵ میکرومتر است.
ستون می تواند قطبی و یا غیرقطبی باشد. از مرسوم ترین ستون های غیرقطبی میتوان به C18، اکتادسیل سیلان ODS)) اشاره کرد. جنس ستونها از فولاد ضد زنگ (Stainless Steel) است. پس از ورود نمونه به ستون، بر اساس تفاوت قطبیت، اجزاء مختلف نمونه در زمان های متفاوتی با نام زمان بازداری (Retention Time) از یکدیگر جدا شده و برای تشخیص نوع ماده به سمت آشکار ساز(Detector) هدایت می شوند.
در نهایت پس از اتمام کار باید ستون را شستشو دهیم. برای شستشو، بسته به نوع ستون، حلال متفاوتی را با ترتیب خاص انتخاب می کنیم. برای مثال در ستون های غیرقطبی پس از اتمام کار، ابتدا ستون را با یک حلال قطبی (معمولا آب ) و سپس با یک حلال غیرقطبی (معمولا متانول) شستشو می دهند.
۵- آشکارساز (Detector): آشکارساز بر اساس نوع آنالیت انتخاب می شود. به طور کل یک آشکارساز خوب باید دارای ویژگی های زیر باشد:
> حساسیت بالا
> غیرتخریبی بودن (Nondestructive): در طول روند شناسایی نمونه را تخریب نکند.
> پاسخ خطی به غلظت در دامنه وسیع (برای سهولت در محاسبات)
درادامه به تعدادی ازآشکارسازهای مرسوم اشاره می شود :
الف- از پر کاربردترین انواع آشکارساز،طیفسنج UV-Vis است که برای اجسامی که در این ناحیه جذب داشته باشند مورد استفاده قرار می گیرد. در این آشکارساز با استفاده از تفاوت میزان جذب نمونه با منبع نوری اولیه و در نهایت با استفاده از قانون بیر لامبرت غلظت نمونه اندازه گیری می شود. در مواردی که از این آشکارساز استفاده می شود انتخاب طول موج مناسب یکی از مواردی است که می بایست مد نظر قرار بگیرد، در طول موج انتخابی، نباید مزاحم های موجود در نمونه و همچنین حلال جذب داشته باشند.
ب- آشکارساز ضریب شکست، اساس کار این آشکارساز بر مبنای تغییراتی است که در ضریب شکست سیستم حلال به تنهایی و سیستم حلال همراه با نمونه، ایجاد می شود.پاسخ این آشکارساز به حرارت وابسته بوده و به همین دلیل معمولا به ندرت ازآن استفاده می-شود.
ج- آشکارساز فلورسانس، حساس تر از آشکارساز UV/Vis است ولی ترکیبات کمی موجودند که خاصیت فلورسانس داشته باشند درنتیجه کاربرد این آشکارساز نیز محدود است.
د- آشکارساز الکتروشیمیایی، که عملکرد آن بر پایه واکنش های اکسید و احیا می باشد و شامل روشهای آمپرومتری (Amperometry)، پلاروگرافی(Polarography)، کلون سنجی (Coulometry) و هدایتسنجی (Conductometry) است.
ه- آشکارساز طیف سنج جرمی (MS): این مورد امروزه به دلیل مزایای زیادی که دارد به طور وسیعی مورد استفاده قرار می گیرد.از این جمله میتوان به حد تشخیص (LOD) بسیار پایین، حساسیت و انتخابگری (Selectivity) بالاو امکان بررسی نمونه در حضور مزاحمهای شیمیایی اشاره کرد.
در صورتیکه از هیچ کدام از این موارد نتوان استفاده کرد، از مشتق سازی (ایجاد تغییرات شیمیایی روی نمونه) جهت ایجاد نمونه فعال در هر یک از این آشکارسازهای ذکر شده استفاده می شود. شکل زیر نمایی از یک دستگاه HPLC را به همراه اجزاء مختلف آن به تصویر کشیده است] [.

یک نمونه کروماتوگرام در شکل ۲ نشان داده شده است که در آن سه نوع قند از یکدیگر جدا شده اند. اطلاعات کمی، نیمه کمی و کیفی از ولتاموگرام قابل استخراج است.

انتخاب نوع روش کروماتوگرافي بجز در موارد واضح (مانند کروماتوگرافي گازي در جداسازي گازها) عموماً تجربي است. زيرا هنوز هيچ راهي براي پيشبيني بهترين روش براي جداسازي اجسام، مگر در چند مورد ساده وجود ندارد.
در ابتدا روشهاي سادهتري مانند کروماتوگرافي کاغذي و لايه نازک امتحان ميشوند. در صورتي که با اين روشها مستقيماً قادر به جداسازي باشند، جداسازي را بايد به وسيلة آنها صورت داد. در غير اين صورت، از روشهاي پيچيدهتر استفاده ميشود.
کروماتوگرافي مايع با کارايي بالا (HELC)، وقتي که روشهاي ساده فاقد کارايي لازم هستند، ميتواند جوابگو باشد.
کروماتوگرافی لایه نازک TLC- Thin Layer Chromatography-
کروماتوگرافی با لایه نازک نوعی از کروماتوگرافی جذب سطحی است که در این روش از صفحات با ضخامت نازک استفاده میشود و موقعیت اجزای جدا شده روی صفحه مشخص میگردد. ذرات روی لایه باید تراکم زیادی داشته باشند و همسان و کوچک باشند. قائم ساکن اغلب از جنس سلولز است که برای جدا سازی مولکولهای هیدروفیلی مثل هیدراتهای کربن ، اسیدهای آمینه ، مشتقات اسید نوکلئیک و مواد معدنی استفاده میشود.
سیر تحولی و رشد
در سال ۱۹۳۸ ایزومیلو و شرایبده استفاده از یک جاذب کروماتوگرافی به شکل یک لایه نازک تثبیت شده بر روی یک تکیهگاه محکم و بیاثر را پیشنهاد کردهاند و در سال ۱۹۵۱ کیر شنر ، میلر ، و کلر ، ترپنها را بر روی یک «نوار کروماتوگرافی» جدا کردند. این نوار از یک باریکه کوچک شیشهای با جاذب مخلوط با نشاسته یا گچ شکستهبندی ، که به عنوان چسباننده عمل میکند، پوشیده شده بود. طرز به کار بردن باریکهها مانند روش به کار بردن کاغذ کروماتوگرافی کاغذی بود و در واقع هدف اولیه استفاده از روش لایه نازک به کار بردن روشهای کروماتوگرافی تقسیمی و کاغذی در یک سیستم جذب سطحی بوده است. در اواخر دهه ۱۹۵۰ استال ، روشهای سادهای را برای تهیه صفحات اختراع کرد و نشان داد که کروماتوگرافی لایه نازک میتواند برای بسیاری از جداسازیها به کار رود.
مکانیزم کار کروماتوگرافی لایه نازک
در ابتدا لازم است که صفحات کروماتوگرافی تهیه شوند، یعنی جاذبه به صورت لایه نازکی با ضخامت یکنواخت روی یک تکیهگاه سفت بیاثر پخش شود. معمولا از صفحات شیشهای استفاده میشود، البته روشهای دیگری نیز وجود دارد. جاذب جامد بصورت پودر ریز را با آب و گاهی با یک مایع فرار ، به صورت خمیر در میآورند، و آن نرا به وسیله دستگاههای پخش کننده تجارتی یا یک پخش کننده خانگی ساده یا حتی تنها با استفاده از دست روی صفحه پخش میکنند. تهیه لایه با استفاده از روش پاشیدن یا فرو بردن نیز امکانپذیر است.
صفحه پوشیده از خمیر را خشک و با گرم کردن در حدود ۱۰۰ ، به مدت از قبل تعیین شده ، آن را فعال میکنند. محلولی از نمونه در یک حلال فرار را به وسیله یک پیپت یا سرنگ روی صفحه قرار میدهند. وقتی که لکه خشک شده صفحه را بطور عمود در مخزن مناسب طوری قرار میدهند که لبه پایینی آن در فاز متحرک انتخاب شده فرو رود، بدین ترتیب جداسازی مواد با استفاده از روش کروماتوگرافی صعودی انجام میشود.
اگر از یک دستگاه پیچیدهتر استفاده شود، میتوان کروماتوگرافی نزولی یا افقی را انجام داد، ولی این روشها کمتر متداول هستند. در پایان عمل ، حلال را از صفحه تبخیر میکنند و لکههای جدا شده را به وسیله روشهای فیزیکی یا شیمیایی ، به ترتیبی که در کروماتوگرافهای کاغذی به کار میروند، آشکار و شناسایی میکنند. شیوه عملی لازم در این روش ، بجز تهیه صفحات ، بسیار شبیه روش کروماتوگرافی کاغذی است.
مقایسه کروماتوگرافی لایه نازک با انواع کروماتوگرافی
مقایسه با کروماتوگرافی ستونی جذب سطحی:
کروماتوگرافی ستونی جذب سطحی متداول ، فرآیندی کند است و مقادیر نسبتا زیادی از جاذب و نمونه لازم دارد. پیشرفتهای اخیر در سیستمهای با کارایی بالا مطمئنا مشکلات سرعت ، مقیاس و شناسایی را از بین بردهاند. ولی این سیستمها قیمت خیلی زیادی دارند و دستگاه مربوط به آنها بسیار پیچیده است. در کروماتوگرافی لایه نازک تنها مقادیر کمی از جاذب و نمونه لازم است، دستگاه ساده و ارزان است.
لکههای جدا شده در روی صفحه مانند کروماتوگرافی کاغذی آشکار میشوند بنابراین ، معمولا جمعآوری اجزا لازم نیست. با وجود این هیچ اشکالی در انجام جدا سازیهای مقدماتی وجود نداشته و جداسازی مواد با افزایش ضخامت لایه و یا به کار بردن مقدار زیادی از نمونه ، بیشتر انجام میگیرد. بعد از جداسازی مواد ، به دست آوردن یک جسم بطور مجزا به طریق فراشیدن و جمع آوری آن قسمت از لایه که جسم بر روی آن جذب شده ، ساده است. بعد از این عمل میتوان جسم را در یک حلال مناسب استخراج کرد.
مقایسه با کروماتوگرافی کاغذی :
روش لایه نازک دارای مزیت عمده سرعت بیشتر ، در اکثر موارد ، جداسازی مواد بهتر میباشد. زمان متوسط برای حرکت حلال به مقدار ۱۰ در کروماتوگرافی لایه نازک روی سیلیکاژل ۳۰ – ۲۰ دقیقه است، در صورتی که همان جداسازی مواد بر روی یک کاغذ سریع ممکن است ۲ ساعت طول بکشد. جداسازی مواد بهتر به این واقعیت مربوط میشود که جاذب در کروماتوگرافی لایه نازک دارای ظرفیت بیشتری نسبت به کاغذ در کروماتوگرافی کاغذی است. بنابراین لکههای جدا شده شکل و اندازه کله اصلی را به طور نسبتا زیادی حفظ میکنند و پخش شدن وابسته به کروماتوگرافی تقسیمی روی کاغذ در لایه نازک صورت نمیگیرد.
کاربرد کروماتوگرافی لایه نازک
کروماتوگرافی لایه نازک پر کاربردترین روش در صنایع داروسازی برای تمام اندازهگیریهای مهم و تعیین درجه خلوص محصولات است. همچنین ، کاربرد گستردهای در آزمایشگاههای بالینی پیدا کرده است و ستون فقرات مطالعات متعدد زیست شناسی و زیست شیمیایی شده است. بالاخره ، کاربرد گستردهای در آزمایشگاههای صنایع شیمیایی پیدا کرده است.
کروماتوگرافی جذب سطحی
کروماتوگرافی جذب سطحی (Adsorption Chromatography) ، نمونهای از کروماتوگرافی مایع – جامد است که در آن عمل جداسازی مواد بعلت متفاوت بودن جذب سطحی اجزای مختلف مخل
ستون کروماتوگرافی جذب سطحی
برای جداسازی مواد یک مخلوط ، میتوان از ستون استفاده کرد. داخل این ستون با جامد فعالی مانند آلومین (فاز ساکن) پر شده است و با حلالی مانند هگزان (فاز متحرک) پوشیده شده است. هرگاه نمونه کوچکی از مخلوط در بالای ستون قرار گیرد ، نواری از ماده جذب شده تشکیل میشود، حلال با عبور خود از میان ستون اجزای مخلوط را با خود حمل میکند.
جداسازی کامل
سرعت حرکت هر جزء ، به میزان جذب سطحی آن بر روی ماده داخل ستون بستگی دارد. به این ترتیب ، مادهای که کم جذب شده است، سریعتر از مادهای که زیاد جذب شده است، حرکت میکند. واضح است که اگر اختلاف بین جذبهای سطحی به حد کافی زیاد باشد، جداسازی مواد کامل انجام خواهد گرفت. اجزایی که قابلیت جذب بالاتری دارند، در قسمت بالای ستون و اجسامی که کمتر جذب میشوند در قسمتهای پایین ستون ، جذب خواهند شد.
نیروهای بین اجزا
این نیروها ممکن است یا از نوع نیروهای واندروالسی ، مانند نیروهایی که در مورد آلومین است یا از نوع نیروهای الکترستاتیک باشند، مانند جداسازی یونها بوسیله کروماتوگرافی تبادل یونی که در آن فاز ساکن یک ماده مبادله کننده یون است ، یا ممکن است از یک ستون که از ماده مناسب متخلخلی پر شده، برای جدا کردن مواد حلشده بر اساس اندازه مولکول آنها استفاده کرد، مانند کروماتوگرافی ژلی.
کروماتوگرافی لایه نازک نمونه ویژهای از کروماتوگرافی جذب سطحی است که در این روش ، به جای اینکه جاذب را در یک ستون استوانهای پر کنیم، آن را بصورت لایه نازک روی یک صفحه شیشهای یا لایه پلاستیکی یا ورقه فلزی قرار میدهیم.
مقایسه با کروماتوگرافی تقسیمی
روشهای جذب سطحی ، برای جداسازی مواد انواع مختلف ترکیبات شیمیایی بهتر هستند. ظرفیت یک ستون جذب سطحی ، در واحد حجم ، غالبا بزرگتر از ظرفیت یک ستون تقسیمی بوده و گاهی این اختلاف خیلی زیاد است.
کروماتوگرافی کاغذی (paper chromatoghraphy)
انواع جداسازیهای مختلف و ساده بر روی کاغذ به عنوان پیشروان کروماتوگرافی کاغذی توصیف شدهاند. این سیستم معمولا به عنوان نمونه بارزی از سیستم تقسیمی در نظر گرفته میشود که در آن فاز ساکن آب است و به وسیله جذب سطحی بر روی مولکولهای سلولز قرار میگیرد و مولکولهای سلولز نیز به نوبه خود به وسیله ساختار الیافی کاغذ در وضعیتهای ثابت نگه داشته میشود. امروزه ، به هر حال ، مشخص شده است که جذب سطحی اجزای فاز متحرک و حل شوندهها و اثرات تبادل یون نیز نقشهایی را ایفا میکنند و کاغذ به هیچ عنوان تنها به صورت تکیه گاه بی اثر نیست.
سیر تحولی رشد
روش پیشنهادی رانگ در سال ۱۸۵۰ و فرآیندی که آن را تجزیه موئینهای مینامند، از جمله آنها میباشند. چنین روشهایی در واقع بیشتر شبیه کروماتوگرافی جذب سطحی بودند و کروماتوگرافی کاغذی به مفهوم فعلی ، گسترش سیستم تقسیمی است که به وسیله مارتین و سینج در سال ۱۹۴۱ ارائه شد. در سال ۱۹۴۴ کونسدن ، گوردن و مارتین اسیدهای آمینه و پپتیدهای موجود در محصول آبکافت ، پروتئین پشم را به وسیله روشی جدا کردند که در آن به جای ستون پودر از یک صفحه یا نوار کاغذی آویزان در داخل یک ظرف سرپوشدار استفاده شده بود.
کاربرد
در ابتدا کروماتوگرافی کاغذی برای جداسازی مخلوطهای مواد آلی به کار رفت. ولی بعد از آن ، عمدتا به وسیله برستال و پولارد و همکاران آنها ، برای جداسازی یونهای معدنی به سرعت به کار گرفته شد. هم آنیونها و هم کاتیونها را به وسیله این روش میتوان جدا کرد.
خصوصیت ویژه
یک خصوصیت ویژه روش کروماتوگرافی کاغذی این است که چیزی مربوط به محلول یا گاز خارج شده از ستون که در سیستمهای معمول مایع یا گاز با آن برخورد میکنیم وجود ندارد. ترکیبات جدا شده روی کاغذ مکانیابی و شناسایی میشوند در نتیجه ، جداسازی به طور نسبتا دائم در روی کاغذ ثبت میشود. در این روش اجزای جدا شده جمع آوری نمیشوند و احتیاجی به وسایل پیچیده کنترل پیوسته نیست. اندازه گیری کمی ترکیبات جدا شده را میتوان روی کاغذ انجام داد ولی اگر بخواهند اجرای را از کاغذ خارج کنند. تنها کار لازم این است که قسمت مربوط به هر یک از اجسام را از کاغذ ببرند و هر یک را به طور جداگانه بشویند.
طرح کلی روش
قطرهای از محلولحاوی مخلوطی که باید جدا شود را روی یک صفحه یا نوار کاغذ صافی در محل علامت گذاری شده قرار میدهند. در این محل ، قطره به صورت یک لکه حلقوی پخش میشود. وقتی که لکه خشک شده کاغذ را در یک ظرف مناسب سربسته طوری قرار دهند که یک سر آن در حلال انتخاب شده به عنوان فاز متحرک فرو رود. حلال از طریق الیاف کاغذ در نتیجه عمل موئینگی نفوذ میکند و نکته مهم این است که سطح کاغذ نباید کاملا به وسیله حلال پوشانده شود. زیرا در این صورت ، اصلا جدا سازی صورت نمیگیرد یا نواحی خیلی پخش میشوند.
وقتی که جبهه حلال مسافت مناسبی را طی کرد یا بعد از یک زمان از قبل تعیین شده ، کاغذ را از طرف بیرون آورده ، جبهه حلال را با علامتی مشخص میکنند و میگذارند تا صفحه خشک شود. وقتی که محلهای مناطق جدا شده آشکار شدند لازم است که هر یک از اجسام به طور جداگانه شناسایی شوند. در موارد ایدهآل ، هر جسم با واکنشگر مکانیاب ، رنگ مخصوصی میدهد که در مورد مواد معدنی بیشتر و درمورد مواد آلی کمتر مشاهده میشود. سادهترین روش شناسایی بر اساس مقدار Rf یعنی نسبت فاصله طی شده به وسیله جبهه حلال است.
خارج کردن جسم از کاغذ
روشهای ارائه شده مستلزم به کارگیری یک واکنشگر مکان یاب شیمیایی برای تعیین محل لکه هستند، و لکههای رنگی اساس ارزیابی را تشکیل میدهند. بعضی اوقات میتوان کمپلکس را شستشو داد و به وسیله روش رنگ سنجی تخمین زد، ولی اگر تغییر شیمیایی قابل قبول نباشد ماده تغییر نیافته را باید شستشو داد. عمل شستشو را میتوان با وارد کردن تکه کاغذ در یک حلال ، به وسیله استخراج در یک دستگاه سوکسیله ، یا با استفاده از آرایش خاصی ، که در کاغذ یک جریان نزولی کروماتوگرافی ایجاد مینماید، انجام داد. برای جداسازیهای معدنی تکههای کاغذ را میتوان به صورت خاکستر در آورده ، باقیماندهها را در اسید حل کرد. نتایج این روش به اندازه روش شستشو خوب نیستند. از اینرو محلولهای به دست آمده را میتوان به وسیله هر روش مناسبی تجزیه کرد، روشهایی که اغلب به دنبال روشهای کروماتوگرافی به کار میروند عبارتند از رنگ سنجی و قطبش نگاری.
پیدا کردن یک روش کروماتوگرافی ، که بتواند به طور کمی تمامی اجزای یک مخلوط را جدا کند، مطلقا ضروری نیست. ارزیابی کمی فلزات با قطبش نگاری و ارزیابی کمی مواد آلی مشکلتر از فلزات است زیرا ، برای مواد آلی ، روشهای موجود برای آزمایش محلول حاصل از شستشو محدودتر هستند. ارزیابی مواد آلی معمولا بر روی کاغذ صورت میگیرند و بنابراین ، لازم است که هر جسمی از اجسام دیگر به طور کمی جدا شود.
نقایص کروماتوگرافی کاغذی
لکههای چند تایی :
در کروماتوگرافی یونها فلزی ، اگر دارای آنیونی متفاوت از آنیون موجود در محلول اولیه باشد، ممکن است رقابتی بین آنیونها برای یون فلزی وجود داشته باشد، که در نتیجه دو لکه به دست میآید که هر یک از آنها مربوط به یکی از نمکهای فلزی میباشد. ممکن است یون فلزی دو کمپلکس متفاوت با حلال ایجاد کند. در جدا سازیهای آلی ، ممکن است جسم دو شکل متفاوت وجود داشته باشد. به عنوان مثال یک آمینو اسید میتواند به صورت کاتیون و یون دو قطبی باشد.
دنباله دار شدن :
اگر مخلوط یه مقدار زیاد از حد روی کاغذ قرار داده شود، یا سرعت عبور حلال متفاوت باشد، جسم نمیتواند برای ایجاد یک لکه مجزا به تعادل برسد. در این صورت این لکه ، در سطح بزرگی از کاغذ پخش شده و از حلال در حال پیشروی عقب میماند. دنبالهدار شدن ممکن است به سبب اثرات جذبی سطحی تر ایجاد شود.
اثرات لبه یا کناره :
لکهها خیلی نزدیک به کنار نوار ، ممکن است در امتداد کنار کاغذ پخش شوند، عمل نفوذ ممکن است به علت بالا بودن غلظت موضعی فاز متحرک در آن ناحیه ، و یا به علت بالاتر بودن سرعت تبخیر حلال در کنار کاغذ ، که منجر به اثرات تقسیمی غیرعادی میشوند، باشد.
روش کمی کروماتوگرافی کاغذی
کاربرد کمی این روش نه تنها احتیاج به یک جداسازی کمی ، بلکه مکانیابی و ارزیابی کمی اجسام موجود نیز دارد. یک جداسازی کیفی رضایت بخش ، الزاما برای کار کمی مفید نیست. اندازه گیری کمی را میتوان یا با سنجش مقدار جسم موجود در لکه روی کاغذ ، یا با خارج کردن جسم از کاغذ و تجزیه اجزای جدا شده به وسیله روشهای کمی متداول انجام داد. لکه اولیه از نمونه مناسب روی کاغذ قرار میدهند، خشک کردن لکه باید تحت شرایط استاندارد زمان و دما صورت گیرد.
در تهیه حلال باید دقت زیادی روی نسبتهای اجزای صورت گیرد، برقرار ساختن تعادل باید به طور استاندارد انجام گیرد، طول عبور حلال در تمامی نوبتها یکسان باشد، در طول آزمایش ، دما باید ثابت بماند، و خشک کردن ورقه باید در یک زمان و دمای استاندارد انجام گیرد. واکنشگر مکانیاب (در صورت استفاده از لکههای رنگی) باید به طریق کاملا تکرارپذیر افزوده شود. و هر عمل بعدی ، مانند خشک کردن یا قراردادن در معرض بخار آمونیاک ، باید در مدت استاندارد انجام گیرد. مقدار جسمی که در یک جداسازی کروماتوگرافی باید روی کاغذ قرار گیرد، متغیر است.
موارد استعمال کروماتوگرافی کاغذی
منابع علمی مربوط به روشهای تجزیهای و بررسی ترکیبات طبیعی نشان میدهد که کروماتوگرافی کاغذی در هر رشتهای کاربرد دارد. با این همه ، این روش هنوز هم در جداسازیهای مواد با ماهیت زیستی وسیعترین کاربرد را دارد.
کروماتوگرافی کاغذی اکثرا به عنوان یک وسیله تحقیقاتی به کار میرود، و به طور گستردهای در تجزیههای روزمره مخصوصا در جداسازیهای جدیدی که هیچ روش کلاسیک برای آنها وجود ندارد، نیز مورد استفاده قرار می گیرد. روش اخیر در مسائل کلینیکی و زیست شیمیایی ، جداسازی اسیدهای آمینه و پپتیدها در بررسی ساختارهای پروتئین کاربد دارد.
آزمایش روزمره ادرار و سایر مایعات بدن برای اسید آمینه و قند ، جداسازی بازهای پورین و نوکلئوتیدها در آزمایش اسیدهای نوکلئیک ، جداسازی استرئیدها ، تجزیه عمومی ، تجزیه بسپارها ، تشخیص و ارزیابی فلزات در خاک ها و نمونه های زمین شناسی ، بررسی ترکیبات فنلی در عصاره های گیاهی ، جداسازی آلکالوئیدها ، جداسازی ترکیبات علامت دار به وسیله رادیو ایزوتوپها ، کروماتوگرافی کاغذی برای جداسازی مواد فرار غیر فعال مانند هیدروکربنها و دیگری جداسازی اسیدهای چرب با فراریت بیشتر مناسب نمی باشد.
کروماتوگرافی تقسیمی
در جداسازی مواد بوسیله کروماتوگرافی تقسیمی در ستون ، شیوه کار بسیار شبیه به شیوه کروماتوگرافی جذب سطحی است. اختلاف اصلی دو روش در ماهیت ماده پر شده در ستون است.
اساس کار کروماتوگرافی تقسیمی
سرعت حرکت یک جزء از مخلوط تابع انحلال پذیری آن در فاز ساکن است. به عبارت دیگر ، جدا شدن اجزا بر اساس تقسیم بین دو مایع است. اجسامی که بیشتر حل میشوند، کندتر از اجسامی که کمتر حل میشوند به طرف پایین ستون حرکت میکنند. در جریان عبور از ستون ، اجسام میان دو فاز تقسیم میشوند و جداسازی مواد بر اساس اختلاف میان ضرایب تقسیم آنها انجام میشوند.
یک مورد خاص
کروماتوگرافی کاغذی مورد خاصی از کروماتوگرافی تقسیمی به شمار میرود که در آن صفحات کاغذی جای ستون پر شده را میگیرند.
خصوصیات
یکی از خصوصیات اساسی کروماتوگرافی این است که مخلوط اجسام ابتدا به صورت یک نوار در ستون که در نتیجه جذب سطحی یا جذب به وسیله فاز ساکن به وجود میآید، ظاهر میشود. برای جداسازی مواد اجزای باید عمل دیگر روی نوار انجام گیرد. تجزیه به روشهای گوناگونی انجام میگیرد.
مقایسه با کروماتوگرافی جذب سطحی
میتوان گفت که روشهای تقسیمی برای جداسازی ترکیبات شیمیایی نزدیک به هم ، مانند اعضای سریهای ترکیبات مشابه ، مناسبتر است. مزیت اصلی روش تقسیمی این است که نوارهای کروماتوگرافی حاصل ، به علت وجود دنباله ، نسبتا باریک و در نتیجه استفاده از ستونها کارآمدتر است. ظرفیت یک ستون تقسیمی ، در واحد حجم ، غالبا کوچکتر از ظرفیت یک ستون جذب سطحی بوده و گاهی این اختلاف خیلی زیاد است.
کروماتوگرافی ژلی
در مطالعات جذب سطحی بر روی سیلیکاژل و کربن فعال ، اثرات الک مولکولی با موادی که جرم مولکولی بالایی دارند، مشاهده شده است. جداسازیهای مبتنی بر الک کردن مولکولی را میتوان بر روی اجسام بیبار در جریان مهاجرت الکترو اسمزی از داخل ژلها انجام داد. این اساس جداسازیهایی را که مبتنی بر اندازههای نسبی مولکولها هستند، تشکیل میدهند و از اصطلاح صاف کردن بوسیله ژل استفاده میشود.
سیر تحولی و رشد
در سال ۱۹۵۴ ، “مولد وسینچ” نشان دادند که جداسازیها مبتنی بر الک کردن مولکولی را میتوان بر روی اجسام بیبار از داخل ژلها انجام داد. در سال ۱۹۵۹ “پورات” و “فلودین” ، اصل معینی را ارائه دادند و از اصطلاح ، صاف کردن بوسیله ژل برای شرح روش خودشان در مورد جداسازی مواد مولکولهایی با منشاء زیستی در سیستمهای آبی بوسیله ژلهای پلیساکارید استفاده کردند.
ولی “دترمان” در سال ۱۹۶۴ پیشنهاد کرد که کروماتوگرافی ژلی ( Gel Cromatography ) ، عمومیترین اسم برای این شیوه است.
نکات قابل توجه این روش
در کروماتوگرافی ژلی ، فاز ساکن از یک قالب بسپار متخلخل تشکیل شده است که منفذهای آن بوسیله حلالی که به عنوان فاز متحرک بکار میرود، کاملا پر شده است. اندازه سوراخ بسیار مهم است چون اساس جدایی بر این است که مولکولیهای بزرگتر از یک اندازه معین اصلا وارد سوراخها نشوند و تمام یا قسمتی از سوراخها برای ورود مولکولهای کوچکتر آماده است. جریان فاز متحرک موجب میشود که مولکولهای بزرگتر بدون برخورد با مانعی ، بدون نفوذ در قالب ژل از ستون عبور کنند، در حالیکه مولکولهای کوچکتر بر حسب شدت نفوذ آنها در ژل در ستون نگه داشته میشوند.
خروج اجزای مخلوط
بدین ترتیب اجزای مخلوط به ترتیب جرم مولکولی نسبی از ستون خارج میشوند، ابتدا بزرگترین مولکول خارج میشود. ترکیباتی که اصلا وارد ژل نمیشوند از یکدیگر جدا نمیشوند و همچنین مولکولهای کوچکی که کاملا در ژل نفوذ میکنند، از یکدیگر جدا نمیشوند. مولکولهای کوچکی که کاملا در ژل نفوذ میکنند از یکدیگر جدا نمیشوند. مولکولهای با اندازه متوسط بر حسب درجه نفوذ آنها در قالب در ستون نگه داشته میشوند. اگر مواد ترکیب شیمیایی مشابه داشته باشند، به ترتیب جرم مولکولی نسبی از ستون شسته میشوند.
مقایسه با کروماتوگرافی تقسیمی
از اثرات جذب سطحی بر روی سطح ذرات ژل معمولا میتوان صرف نظر کرد و در نتیجه کروماتوگرافی ژلی را میتوان بهعنوان نوعی کروماتوگرافی تقسیمی در نظر گرفت. مایع موجود در داخل قالب ژل ، فاز ساکن و شوینده سیالی که بقیه ستون را پر میکند، فاز متحرک را تشکیل میدهند. بهعبارت دیگر ، یک ستون تقسیمی داریم که در آن دو فاز مایع ، متحرک و ساکن ، ترکیب یکسانی دارند.
ماهیت ژل کروماتوگرافی
ژل باید تا حد ممکن از نظر شیمیایی بیاثر و از نظر مکانیکی تا حد امکان پایدار باشد. مواد ژلی بصورت دانه تهیه میشوند و لازم است همانند رزینهای تبادل یونی ، اندازه ذرات نسبتا یکنواخت باشد و تخلخل یکنواختی داشته باشد.
نمونه
گرانروی نمونه مهم است و نباید از دو برابر گرانروی شوینده بیشتر باشد. حجم نمونه نیز مهم است. هر قدر حجم نمونه کمتر باشد، کاهش غلظت هر جزء در محلول خارج شده بیشتر خواهد بود. این اثر رقیق شدن در تصمیمگیری در مورد اندازههای ستون و نمونه باید مد نظر قرار گیرد.
کاربرد کروماتوگرافی ژلی
با اینکه این روش بیشتر برای جداسازیهایی در مقیاس کوچک در کارهای تحقیقاتی و تجزیههای روزمره بکار میرود، ولی کاربردهایی نیز در مقیاس بالاتر در تولیدات صنعتی دارد. کروماتوگرافی ژلی ابتدا برای جداسازی مواد مولکولهای بزرگی که منشاء زیستی دارند، مانند پروتئینها ، پلیساکاریدها ، اسیدهای نوکلئیک و آنریمها بکار رفت و هنوز هم بیشترین کاربرد این روش در همین زمینهها است.
اخیرا جداسازی مواد و بررسی بسپارهای مصنوعی ، حدود کاربرد این روش را افزایش دادهاند و این روش ، قسمت مهمی از تکنولوژی بسپارها شده است. نمکزدایی از محلولها برای مثال از پروتئینها، یکی از کاربردهای مهم محیطهای ژلی است.
آنالیز کیفی، برای تشخیص و شناسایی نوع ترکیبات انجام می شود. از آنجایی که زمان بازداری (Retention Time) برای هر ماده در یک سیستم و شرایط خاص آزمایشگاهی ثابت و مشخص می باشد، می توان از آن جهت تعیین نوع آنالیت استفاده کرد. به این منظور کروماتوگرام آنالیت را با کروماتوگرام به دست آمده از استاندارد آن آنالیت مقایسه می کنند. در صورت یکسان بودن زمان بازداری می توان با قطعیت نوع ماده را تعیین کرد. ذکر این نکته لازم است که این مقایسه این دو کروماتوگرام تنها در شرایط آزمایشگاهی و دستگاهی کاملاً یکسان معتبر است.
۴-۲ آنالیز کمی:
به منظور تعیین کمی مقدار آنالیت، سطح زیر پیک و یا ارتفاع پیک ترکیب مجهول را با نمونه استاندارد مقایسه می¬کنند. در مواردی که پیک ها باریک و متقارن باشند، اندازه گیری ارتفاع پیک از صحت و سرعت بیشتری برخوردار است. هر چند که امروزه به راحتی می توان ارتفاع و سطح زیر پیک را به کمک دستگاه های الکترونیک با دقت و صحت بالایی محاسبه کرد. روشهای مختلفی جهت محاسبه مقدار مجهول وجود دارد که در ادامه به برخی از این روشها اشاره می شود:
۴-۲-۱ روش استاندارد خارجی (External Standard):
در این روش، محلولهایی با غلظت های مختلف از استاندارد (استاندارد آنالیت مورد نظر) ساخته شده و سپس بر اساس ارتفاع یا سطح زیر پیک بدست آمده از کروماتوگرام این استانداردها، منحنی کالیبراسیون ( منحنی ارتفاع و یا سطح زیر پیک، بر حسب غلظت) رسم می شود. با استفاده از معادله خط بدست آمده، مقدار ارتفاع و یا سطح زیر پیک نمونه مجهول، مقدار دقیق آنالیت محاسبه می شود.
۴-۲-۲ روش افزایش استاندارد (Standard Addition):
در این روش ابتدا ماده مجهول، آنالیز می شود، سپس به چند ظرف که حاوی مقدار یکسانی از نمونه است، حجم های مشخصی از استاندارد اضافه می شود و کروماتوگرام مربوط به هر مرحله را آنالیز و در نهایت ارتفاع یا سطح زیر پیک نمونه ها را بر اساس حجم استاندارد اضافه شده رسم می کنند. در نهایت با استفاده از روابط موجود می توان غلظت نمونه را محاسبه کرد. استفاده از این روش سبب حفظ بافت و ماتریس نمونه ها می شود در نتیجه با این روش احتمال مزاحمت بافت (Matrix Interference) نمونه از بین برده می شود.] [
۴-۲-۳ استاندارد داخلی (Internal Standard):
دو نوع خطا (سیستماتیک و تصادفی) در سیستم موجود است. برخی از این منابع ثابت را می توان با اضافه کردن یک استاندارد داخلی به نمونه ها و تقسیم ارتفاع پیک یا سطح زیر پیک مربوط به هر آنالیت بر همین مقادیر مربوط به استاندارد داخلی، حذف کرد. در انتخاب استاندارد داخلی باید به شباهت های ساختاری آنالیت با جزء انتخابی، نزدیک بودن زمان بازداری پیک آن به پیک نمونه و ..، توجه کرد. با انتخاب یک استاندارد داخلی مناسب می توان خطا را از ۱ تا ۲ درصد به ۵٫۰ تا ۱ درصد کاهش داد.
۵- نتیجه گیری:
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، روشی مناسب جهت جداسازی، اندازه گیری، و تعیین نوع مواد است. این تکنیک با تلفیق با روشهای دیگر و آشکارسازهای پیشرفته ای مانند طیف سنج جرمی کاربرد های زیادی در علوم مختلف دارد. انتخاب فاز متحرک و ثابت، انتخاب آشکارساز و تعیین سرعت جریان فاز متحرک از جمله موارد اساسی در تنظیمات یک روش مناسب HPLC است.
منابـــــع :
- ۱٫ Skoog, D.A. “Principle of Instrumental Analysis”, 3nd Edition, USA: Saunders College Publishing, (1985).
- ۲٫ Rouessac, F, Rouessac, A. “Chemical Analysis Modern Instrumentation Methods and Techniques” 2nd Edition, England, John Wiley & Sons Ltd, (2007).
- ۳٫ اسگوگ، هالر، نیمن، “اصول تجزیه دستگاهی” ترجمه: عبدالرضا سلاجقه، چاپ اول، تهران، مرکز نشر دانشگاهی،جلد اول (۱۳۸۲)
Review Overview
بازدیدها: 2882
سلام ممنونم مطالب جالبی بودند