ویتامین D و متابولیت هایش

ویتامین D بصورت اندوژن از طریق مجاورت با نور خورشید در بدن تولید می شود و یا از طریق مصرف مواد غذایی حاوی ویتامین D و یا مصرف مکمل های غذایی (ویتامینD) وارد بدن می شود.

ویتامین D در بدن به فرم فعال خود یعنی ۱ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D (1,25(OH)₂ D)  که یک هورمون تنظیم کننده متابولیسم فسفر و کلسیم است، تبدیل می شود. کمبود ویتامین D باعث اختلال در شکل گیری استخوان ها، نرمی استخوان در کودکان و استئومالاسیا در بزرگسالان می شود.

بیوشیمی و فیزیولوژی

ویتامین D و متابولیت هایش ممکن به عنوان کله کلسیفرول یا ارگوکلسیفرول تقسیم بندی شوند. (شکل ۲۰-۵۲) . کله کلسیفرول (vitamin D3) یک ترکیب از خانواده ویتامین D است که به طور طبیعی در پوست از ۷ – دهیدروکلسترول در اثر مجاورت با پروتئین B اولترا ویولت نورخورشید تولید می شود.

موقعیت جغرافیایی، فصل، سن، مصرف کرم های ضد آفتاب و رنگ پوست، تولید ویتامین D3 به وسیله پوست را تحت تأثیر قرار می دهد. ویتامین D2 ( ارگوکلسیفرول) یک ترکیب دیگر از خانواده ویتامین D ها است که بوسیله ی تابش به ارگوسترول تولید شده به وسیله ی مخمر ها ساخته می شود.

ویتامین D2 از ویتامین D3 به واسطه یک پیوند دوگانه بین کربن ۲۲ وکربن ۲۳ و همچنین یک گروه متیل برروی کربن ۲۴ متفاوت و متمایز می شود.

هر گاه ویتامین D یا متابولیت هایش بدون اندیس و زیرنویس نوشته شوند، هر دوخانواده را شامل می شوند.

تنها تعداد محدودی از غذاها به طور طبیعی حاوی مقادیر قابل توجه ویتامین D هستند که در درجه اول روغن کبد ماهی، ماهی چرب، زرده تخم مرغ و جیگر را می توان نام برد.

قبل از اینکه غذاها با ویتامین D2 و یا D3 غنی شوند، اکثر ویتامین D در بدن در پوست ساخته می شد. در شمال امریکا کسر قابل توجهی از ویتامین D به وسیله ی جذب از غذاهای مستحکم (بعضی غلات، نان و شیر) و یا مکمل های ویتامین D کسب و تأمین می شود. مقدار پیشنهادی آن روزانه ۴۰۰IU (10Mg) می باشد.

در بعضی کشورهای اروپایی، پیشنهاد برای افراد بالای ۶۰ سال، IU800 یا Mg20 می باشد. به هر حال بعضی پزشکان در ایالات متحده امریکا، تا میزان IU2000 روزانه ویتامین D را جهت درمان یا پیشگیری از پوکی استخوان و اطمینان از جذب بهینه کلسیم رژیم غذایی تجویز کرده اند.

متابولیسم، تنظیم و انتقال

ویتامین های D₃, D₂ در کبد به وسیله آنزیم ۲۵ هیدروکسیلاز ویتامین D که یک آنزیم سیتوکروم P450 است، متابولیزه می شوند (شکل ۲۱- ۵۲) . غلظت آنزیم ویتامین D-25- هیدروکسیلاز در سرم حداکثر ۱۰-۶۵ ng/ml یا ۲۵- ۱۶۲ nmd/l (جدول ۴-۵۲) می باشد. نیمه عمر گردش ویتامین D 25 هیدروکسیلاز بین ۲ تا ۳ هفته است. در غلظت نزدیک به ۳۰ ng/ml آنزیم ویتامینD  ۲۵ هیدروکسیلاز، جذب کلسیم رژیم غذایی بیشترین میزان است. بنابراین هر مقداری (reference interval) برای آنزیم ویتامین D 25 هیدروکسیلاز نباید بارنج بهینه و مطلوب و healthy آن اشتباه گرفته شود. در غلظت های فیزیولوژیک، ویتامین D 25 هیدروکسیلاز از نظر بیولوژیکی در جذب کلسیم رژیم غذایی غیرفعال است و تأثیری ندارد.

ویتامین D₂ و ویتامین D₃ به ۲۵و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D ((OH)₂ D 1,25) به عنوان یک هورمون فعال بیولوژیکی، بوسیله ۱-  هیدروکسیلاز ۲۵ ویتامین D (آنزیم سیتوکروم P450) در کلیه ها و جفت متابولیزه می شوند (شکل ۲۱- ۵۲) .

غلظت های در گردش نرمال آن، حداکثر ۶۰- ۱۵ pg/ml یا pmol/L 144- 36 ، در حدود  آنزیم ویتامین D 25 هیدروکسیلاز می باشد(جدول ۴- ۵۲) . نیمه عمر ۱و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D بین ۶- ۴ ساعت است. غلظت های در گردش ۱ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D به شدت در درجه اول به وسیله ی PTH، فسفات، کلسیم و خود ۱ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D ((OH)2 D 1,25) تنظیم می شود. PTH و هیپوفسفاتمی، سنتز ۱ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D به وسیله افزایش فعایت ویتامین D 25 هیدروکسی-۱-  هیدروکسیلاز را افزایش می دهد؛ همان طور که هیپوکلسیمی به طور غیر مستقیم به وسیله ی تحریک ترشح PTH این  عمل افزایش را انجام می دهد.

هیپرکلسمی، هیپرفسفاتمی و ۱ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D ، ۲۵ هیدروکسی ویتامین D   – ۱هیدروکسیلاز و ۱ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین  D را کاهش می دهد.

۲۵-۱ دی هیدروکسی ویتامین D، ۲۵ هیدروکسی ویتامین D 24 – هیدروکسیلاز را القاء ی کند، آنزیمی که ۲۴ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D، شایع ترین فرم دی هیدروکسیله ویتامین D  در سرم را تولید می کند.

این آنزیم همچنین مسئول غیرفعال کردن ۱ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D از طریق مسیر ۲۴- اکسیداسیون که منجر به تشکیل اسید کلی تروئیک میشود، می باشد.

در گردش خون، ویتامین D، ۲۵ هیدروکسی ویتامین D و ۱و ۲۵دی هیدروکسی ویتامین D به پروتئین باند شونده به ویتامین D (DBP) که یک پروتئین انتقالی اختصاصی با تمایل بالاست که به عنوان G-C گلوبولین یا ترکیب اختصاصی گروه سرم نیز شناخته می شود، باند می شود. DBP جزء خانواده  – فتوپروتئین و آلبومین است. در انسان ها، DBP حاوی ۴۵۸ آمینواسید با وزن مولکولی ۳۳۵/۵ دالتون می باشد که به طور دائم به وسیله ی کبد سنتز می شود و به مقدار بالا ( در حدود  ۴۰۰ میلی گرم/ لیتر) در خون گردش می کند که تنها کمتر از ۵% جایگاه های اتصال ویتامین D آن اشغال است. DBP به ویتامین Dو متابولیت های آن بخصوص متابولیت های ۲۵- هیدروکسیله ویتامین D ، ۲۴ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D و ۲۵و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D متصل می شود. تنها ۰۳/۰ % از ۲۵ هیدروکسی ویتامین D و ۴/۰% از ۱ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D به طور معمول در پلاسما به صورت آزاد هستند. (جدول ۴- ۵۲) . غلظت DBPدر زمان بارداری و هنگام استروژن  درمانی افزایش و در سندرم نفروتیک کاهش می یابد.

عملکرد بیولوژیک ۱ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D

۱ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D به حفظ سطح فسفات و کلسیم خون از طریق عملکرد آن برروی روده کوچک، استخوان، کلیه و پاراتیروئید کمک می کند. در روده کوچک، ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D ، جذب کلسیم را بخصوص در دئودنوم و جذب فسفات را در ژژونوم و ایلئوم تحریک می کند. سه اتفاق جذب کلسیم از رژیم غذایی شامل :

۱- ورود کلسیم به border  brush  سیتوپلاسم به واسطه ی انتقال دهنده اپیتلیالی Ca²⁺ و یا کانال (CaT1 ژن ECAC2 برروی Ch 7q 34)

۲- انتشار کلسیم به داخل سلول پرورش داده شده(fostered) با calbindin-D9k که یک پروتئین سیتوزولی باند شونده به کلسیم است ]ژن symbol S100G مستقر برروی کروموزوم X ، و مجزا از calbindin-D28k مستقر برروی کروموزوم ۸ (ژن symbol CALB1)[

۳- خروج کلسیم از سلول از طریق غشاء basolateral به وسیله ی عملکرد Ca ATPase ( برای مثال N^a+/Ca²⁺).

 سنتز CaT1 تقریباً به میزان ۹۰% وابسته به ویتامین D است و سنتز Calbindin D کاملاً به ویتامین D  وابسته است. از آنجائیکه موش های Knockout شده فاقد بیان Calbidin-D ، در جذب کلسیم نقصی نشان نمی دهند و از طرف دیگر جذب کلسیم را در پاسخ به ویتامین D افزایش می می یابد؛ ضرورت Calbindin-D9K برای جذب کلسیم سوال برانگیز است.

رژیم غذایی با کلسیم بالا، بیان CalbindinD و۱ CaT را به وسیله ی کاهش محصولات ۱ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D کاهش می دهد.

درغلظت های بالا، ۱و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D ، باعث افزایش باز جذب، از طریق القاء سلولهای بنیادی مونوسایتیک به تمایز به استئوکلاست در مغز استخوان و از طریق تحریک استئوبلاست ها به تولید سیتوکین ها و دیگر فاکتورهایی که فعالیت استئوکلاست را تحت تأثیر قرار می دهند، می شود.

با تحریک استئوبلاست ها، ۱و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D نیز، غلظت آلکالین فسفاتاز و استئوکلسین در گردش را افزایش می دهد. در کلیه ها، ۱ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D سنتز خودش را در یک لوپ فیزیکی منفی بسیار کوتاه مهار می کند و متابولیسم خودش را تحریک می کند.

همچنین ۱ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D به طور مستقیم برروی غدد پاراتیروئید در مهار سنتز و ترشح PTH تأثیر می گذارد. علاوه بر مکانیسم رونویسی مستقیم، ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D، غلظت رسپتورهای حس گر کلسیم در  غده پاراتیروئید را افزایش می دهد؛ بنابراین غده را نسبت به مهار کلسیمی حساس می کند.

در بافت های هدف، ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D عملکرد خود را از طریق ارتباط و اتصال به رسپتور هسته ای اختصاصی ویتامینD (VDR)، آنالوگ رسپتورهای استروئیدی برای آندروژن ها، استروژن ها و کورتیکواستروئیدها اعمال می کند. (فصل ۵۴ و ۵۶) . این رسپتور به میزان بسیار وسیعی در بافت ها بیان می شود و اکثر سلولها نسبت به ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D پاسخ می دهند. رسپتور ویتامین D  می تواند یک هترودایمر با رسپتورهای X رتینوئید غشایی تشکیل دهد. رسپتور ویتامین D  یکی از اعضاء خانواده NR1 I است که از دیگر اعضای آن می توان به PXR (Pregnane X Receptor) و CAR (Constitutive Androstane Receptor) نام برد . ژن رسپتور ویتامین D برروی کروموزوم شماره ۲۱ بازوی q (21q1) قرار گرفته است. رسپتور ویتامین D₃،  ۴۲۷ آمینواسید طول دارد و از طریق آمینواسیدهای ۲۱ تا ۹۶ با فرم NR C4-type Zing finger در دو موقعیت ۲۴- ۴۴ و ۸۴- ۶۰ به DNA متصل می شوند. ناحیه ی لولا شامل آمینواسیدهای ۹۷-۱۹۱می باشد. ناحیه ی متصل شونده به لیگاند به آمینواسیدهای ۱۹۲-۴۲۷  همراه با ناحیه باند شونده به ویتامین D در آمینواسیدهای ۲۲۷- ۲۳۷ و ۲۷۱-۲۷۸ محدود می شود.

رسپتورها به طور طبیعی بسیار متنوع هستند :

موقعیت های:

حداقل یک تغییر طبیعی در موقعیت ۲۷۴ (R®L) تمایل لیگاند به میزان ۱۰۰۰ برابر کاهش می دهد.

علاوه بر تأثیرات کلاسیکی ویتامین D برروی متابولیسم کلسیم، شواهد بسیاری نقش ۲۵و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D را در تنظیم پاسخ های ایمنی و در تمایز اپتیلیالی پیشنهاد می کنند.

بین غلظت متابولیک ویتامین D در خون و شیوع سرطان های خاص و تنوعی از دیگر اختلالات، رابطه معکوس وجود دارد.

این یافته ها منجر به افزایش نیاز برای تست کردن ویتامین D و باعث افزایش درخواست مصرف روزانه ویتامین D شده است.

با وجود کاهش قابل توجه در میزان گسترش سرطان های متنوع از طریق استفاده از ویتامین D ، نشان دادن آن در آزمایشات بالینی و کلینیکی مشکل است.

اهمیت  بالینی

تعیین سطح ۲۱ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D ممکنه در تشخیص افتراقی هایپرکلسمی، هیپوکلسمی یا هیپرکلسی اوریا و برای ارزیابی وضعیت ویتامین D در سلامت و استخوان و اختلالات مینرال مفید باشد. تنها اندازه گیری ۲۵ هیدروکسی ویتامین D و ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D ارزش بالینی را اثبات کرده اند؛ اندازه گیری های ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D به ندرت نیازمند عملکرد بالینی فوق تخصصی یا حتی روتین می باشد. راهنماهای National Kidney Foundation تأکید کرده است که غنی بودن از لحاظ ویتامین D به وسیله ی اندازه گیری ۲۵-هیدروکسی ویتامین D تعیین می گردد نه با اندازه گیری ۱و۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D . معیارهای بالینی روتین ویتامین D ،  ۲۴ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D و یا دیگر متابولیت های آن گفته نشده است. وضعیت nutritional ویتامین D از طریق اندازه گیری ۲۵ هیدروکسی ویتامین D در مقایسه با ویتامین D بخوبی مشخص می شود زیرا :

۱) ۲۵ هیدورکسی ویتامین D ، فرم اصلی در گردش ویتامین D است.

۲) بدلیل نیمه عمر بالای آن (که در نتیجه آن، ۲۵ هیدروکسی ویتامین D به وسیله تغییرات روز به روز، مجاورت با نور خورشید یا غذا خوردن، کمتر تت تأثیر قرار می گیرد.)

۳) اندازه گیری ۲۵ هیدروکسی ویتامین D در مقایسه با  بیشتر روشهای پیچیده تکنیکی مورد استفاده جهت اندازه گیری ویتامین D نسبتاً ساده تر است.

گروه های پر خطر در معرض کمبود ویتامین D شامل نوزادان شیرخوار، گیاه خوارانی که به شدت از خوردن تخم مرغ و شیر امتناع می کنند، افراد با رنگ پوست تیره و افراد مسن می باشند.

اندازه گیری ۲۵ هیدروکسی ویتامین D در گردش، در بیماران انتخاب شده جهت ارزیابی هیپوکلسمی، وضعیت ویتامین D، بیماری های استخوان و دیگر اختلالات متابولیسمی مینرال، مفید و سودمند است.

غلظت در گردش ۲۵- هیدروکسی ویتامین D ممکنه کاهش پیدا کند به وسیله ی :

۱) کاهش دسترسی به ویتامین D

۲) تبدیل ناکافی ویتامین D به ۲۵ هیدروکسی ویتامین D

۳) تسریع متابولیسم ۲۵ هیدروکسی ویتامین D

۴) دفع ادراری ۲۵ هیدورکسی ویتامین D همراه با پروتئین و انتقال دهنده اش DBP

کاهش دسترسی به ویتامین D در نتیجه در معرض ناکافی در نور خورشید، سوء تغذیه ، سندرم های سوء جذب، برداشت قسمتی از روده کوچک یا معده اتفاق میفتد.

بیماری جدی هپاتوسلولار با تبدیل ناکافی ویتامین D به ۲۵ هیدروکسی ویتامین D مرتبط است.

داروهایی مثل فنیتوئین، فنورباربیتال و ریفامپین باعث القاء آنزیم های متابولیزه کننده دارو که تسریح کننده متابولیسم ویتامین D و متابولیت هایش است، می شود.

غلظت سرمی ۲۵ هیدورکسی ویتامین D ممکنه در بیماران با سندرم نفروتیک بدلیل دفع و از دست دادن ۲۵ هیدروکسی ویتامین D همراه با DBP از طریق ادرار، کاهش یابد.

غلظت سرمی ۲۵ هیدروکسی ویتامین D به طور معمول به عنوان یک نشانگر عملکرد وضعیت ویتامین D افراد، مورد قبول است. مطالعات غلظت های سرمی ۲۵ هیدروکسی ویتامین D پیشنهاد می کنند که نسبت قابل توجهی از افراد بالغ و بزرگسال در اروپا و شمال امریکا به میزان کافی ویتامین D دریافت نمی کنند. هماهنگ کردن فاصله مرجع ۲۵ هیدروکسی ویتامین D بکار رفته در آزمایشگاه های مختلف، بسیار مشکل است که ممکنه به دلیل اختلاف نظر در تعریف بالینی از کمبود ویتامین  Dدر جمعیت های سالم حاضر باشد. (مراجع زیر را ببینید).

در بیماران با هایپرکلسمی، اندازه گیری ۲۵ هیدروکسی ویتامین D دارای مقادیر محدودی است. بیشترین کاربرد آن در چنین شرایطی، در تأیید مسمومیت بعد از خوردن مقدار زیاد ویتامین D یا ۲۵ هیدروکسی ویتامین D است؛ در چنین بیمارانی غلظت ۲۵ هیدروکسی ویتامین D به طور معمول بیشتر از ng/ml 100 یا ۲۵۰ nmal/l می باشد. راهنمای سال ۲۰۱۱ از مجمع اندوکرین پیشنهاد می کند که  غربالگری روتین برای کمبود ویتامین D ، براساس جمعیت وارانتی نمی شود ولی در افراد با خطر کمبود، وارانتی می شود.

کاندیدهای غربالگری بصورت زیر لیست شدند: بیماران با

۱) نرمی استخوان

۲) استئومالاسیا

۳) پوکی استخوان

۴) بیماریهای مزمن کلیوی

۵) نارسایی کبدی

۶) سندرم های سوء جذب ( کیستیک فیبروزیز ، بیماری التهابی روده (IBD) ، بیماری کرون، جراحی برای چاقی، انتریت ناشی از پرتوتابی )

۷) هایپرپاراتیروئیدیسم

۸) داروها (داروهای ضد تشنج، گلوکوکورتیکوئیدها، داروهای ایدز، ضد قارچ مثل کتوکونازول و کلسیترآمین)

۹) کودکان و بزرگسالان افریقایی، امریکایی و هیسپانیک

۱۰) خانم های باردار و شیرده

۱۱) افراد مسن با سابقه سقوط

۱۲) افراد مسن با سابقه شکستگی غیرترومایی

۱۳) افراد و کودکان بسیار چاق با kg/m² 30 >  BMI

۱۴) اختلالات تشکیل گرانولوما (سارکوئیدوزیس، توبرکلوزیس، هیستوپلاسموزیس، کوکسیدیومایکوزیس، بریلیوزیس)

۱۵) بعضی لنفوماها

اندازه گیری ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D در افراد با نرمی استخوان تیپ ۱ و ۲ وابسته به ویتامین D و بیماریهای مرتبط با تولید بیش از حد ۱ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D مثل سارکوئیدوزیس، توبرکلوزیس، بیماری Hodgkin’s ، عفونت قارچی، گرانولو ماتوزیس wegener’s و لینفوما دارای ارزش تشخیصی است.

تحقیقات اخیر نشان می دهد که ماکروفاژهای فعال شده، ۲۵ هیدورکسی ویتامین D را به ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D تبدیل می کنند. در دیگر موقعیت ها، نتیجه آزمایش،  اطلاعات تأییدی در ارزیابی و بررسی هایپرکلسمی، هایپرکلسی اوریا، هیپوکلسمی و اختلالات استخوانی و مینرال است (۱۰ – ۵۲ Box). غلظت های ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D در نرمی استخوان وابسته به ویتامین D تیپ ۲ ( در نتیجه VDR غیر عملکردی) و در مسمومیت ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D افزایش یافته است . همچنین  ممکنه در هایپرپاراتیروئیدیسم درجه اول افزایش یابد، گرچه تشخیص هایپرپاراتیروئیدیسم درجه اول، نیازمند اندازه گیری ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D نیست. بیماران با هایپرپاراتیروئیدیسم درجه اول و غلظت های بالای ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D نسبت به ابتلاء به هایپرکلسی اوریا و سنگ های کلیه مستعدتر هستند. غلظت های کاهش یافته ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D در بیماران با نارسایی کلیه، هایپرکلسمی بدخیم، هایپرفسفاتمیا، هیپوپاراتیروئیدیسم، سودوهیپوپاراتیروئیدیسم، نرمی استخوان وابسته به ویتامین D تیپ I، هیپومنیزیمی، سندرم نفروتیک و بیماری هپاتوسلولار جدی مشاهده شده است.

به غیر از موارد مشکوک به نرمی های استخوان مقاوم به ویتامین D ، اندازه گیری ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D در چنین مواردی جهت تشخیص نیازی نیست و ارزش تشخیصی ندارد.

تشخیص کمبود ویتامین D براساس اندازه گیری ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D نیست، گرچه بدلیل هایپرپاراتیروئیدیسم غلظت گردش این متابولیت اغلب نرمال است.

هیچ آزمایش مفید و سودمندی جهت تأیید مسمومیت با ویتامین D یا ۲۵ هیدورکسی ویتامین D وجود ندارد زیرا در این شرایط، غلظتهای ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D ممکنه پائین، بالا و یا نرمال باشد.

اندازه گیری متابولیت های Vitamin D

آزمایشات حساس و اختصاصی برای اندازه گیری ویتامین D و ۲۵ هیدورکسی ویتامین D و ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D گسترش یافته اند. آزمایشات ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D و ۲۵ هیدورکسی ویتامین D باید متابولیت های D₂ و D₃ را به میزان مساوی و برابر (با واکنش اکی مولار) اندازه گیری کنند زیرا هم D₂ و هم D₃ جهت تولید فرم فعال بیولوژیکی ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D متابولیزه می شوند.

اندازه گیری جداگانه فرم های D₂ و D₃ ضرورتاً بین رژیم غذایی و منابع اندوژن ویتامین D به اندازه غذاهای غنی شده با D₂ و D₃  تفکیک قائل نمی شود.

ذات و طبیعت هیدروفوب (آبگریز) و غلظت های پائین در گردش متابولیت های ویتامین D همراه با احتمال تأثیرات ماتریکسی، چالش های عظیم و بزرگی را برای گسترش آزمایشات که همه اختصاصی باشند و هم از لحاظ نیازهای آنالیز بالینی مناسب و سودمند باشند، ایجاد کرده است.

معمولاً ، دو یا سه مرحله از مراحل ذکر شده در هر آزمایش ۲۵ هیدروکسی ویتامین D یا ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D نیاز می باشد:

۱) دپروتئینه کردن یا استخراج

۲) خالص سازی

۳) Quantification تعیین خواص و کمی سازی

در اولین مرحله، متابولیت ها از DBP آزاد می شوند و تا حدی خالص می شوند. طی مراحل خالص سازی اغلب به کمک ستون کروماتوگرافی  فرم های متنوعی از ویتامین D ، لیپیدها و مواد مداخله کننده را جدا می کنند. روش تعیین خواص کپی سازی وابسته به متابولیتهایی است که اندازه گرفته شده اند.

استخراج و دپروتئینه کردن

پیش از ظهور متدهای (روشهای ) در دسترس تجاری، کاربرد دو فاز معمول بود، تفکیک مایع- مایع با حلال های آلی و مخلوط حلال های شامل متیلن کلراید، هگزان، دی اتیل اتر، اتانول / کلروفرم /آب، متیلن کلراید /متانول، هگزان / ایزوپروپانول و سیلکوهگزان/ اتیل استات. اتانول و متانول جهت آزاد کردن ۲۵ – هیدروکسی ویتامین D از DBP هنگامی که ۲۵ هیدروکسی ویتامین D اندازه گیری می شود.

امروزه، بیشترین روش تجاری در دسترس از استونیتریل جهت دپروتئینه کردن نمونه و جهت دناتوره کردن DBP و بنابراین آزاد سازی متابولیت های ویتامین D استفاده می کند. یک روش دیگر از استخراج ایمنی (immunoextraction) برای استخراج ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D استفاده می کند.

ستون کروماتوگرافی

تفاوت در بار (پلارتیه) آن هاکه به تعداد گروه های هیدروکسیل شان مرتبط است، جهت جداسازی ویتامین D و متابولیت هایش بکار رفته است. با سه گروه هیدروکسیل، ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D بسیار نسبت به ۲۵ هیدروکسی ویتامین D با دو گروه هیدروکسیل، قطبی تر (پلارتر) است و آن هم نسبت به ویتامین D با یک گروه هیدروکسیل، قطبی تر است.

عصاره ها به وسیله ی ستون کروماتوگرافی خالص شده اند، برای مثال ستون های کوچک سیلیکا، اسید سیلیسیک، سفادکس LH-20، هیدروکسی آلکوکسی پروپیل سفادکس LH-20 (Lipidex 5000) ، سلیت و آلومینا. استخراج فاز جامد با بکار بردن اکتا دسیل (C₁₈) سیلیکا به میزان بسیار وسیعی برای اندازه گیری ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D به کار می رود.

معروف ترین روش هر دو ستون کوچک (مینی ستون) فاز معکوس C₁₈– سیلیکا و فاز نرمال سیلیکا را جهت جدا سازی متابولیت های ویتامین D به کار می برد. این روش با حذف کارتریج سیلیکا و به کار بردن فاز تعویض (switching phase) با یک کارتریج منفرد OH C₁₈non- end – capped اصلاح و تعدیل می شود.

اندازه گیری ۲۵ هیدروکسی ویتامین D

قبول و پذیرش ۲۵ هیدروکسی ویتامین D سرم به عنوان یک نشانگر وضعیت ویتامین D افراد، باعث گسترش چندین آزمایش تجاری در طول ۱۵ سال گذشته شده است.

متابولیت به وسیله ی آزمایش رقابتی پروتئین باند شونده (CPBA)، آزمایش ایمنواسی رقابتی و غیر رقابتی (ICMA, EIA, RIA) ، جذب (UV) ماوراء بنفش بعد از جداسازی به وسیله ی HPLC و یا به وسیله ی اسپکترومتری توده (mass ) بعد از جداسازی به وسیله ی کروماتوگرافی، اندازه گیری می شود.

تعیین به وسیله ی HPLC همراه با جذب UV ، نیازمند دستگاه HPLC مناسب ، آموزش های اختصاصی و مقدار

بیشتری نمونه می باشد. آزمایشگاه های بالینی که ۲۵ هیدروکسی ویتامین D را اندازه گیری می کنند، روش های

معمول تر ایمنواسی رقابتی و یا CPBAs را انتخاب کرده اند. این آزمایشات و روش ها نسبتاً راحت هستند، به طور گسترده ای مجموعه عوامل در دسترس را به کار می برند و تنها نیازمند مقدار کمی از پلاسما هستند. در تحقیق سال ۲۰۱۱  CAP در ۱۵۱ آزمایشگاه (اکثراً در امریکا) دو روش برای دوسوم نتایج استفاده شد:

– ۵۴ آزمایشگاه نتایج خود را به وسیله ی آزمایش LC – MS/MS گزارش کردند.

– ۵۰ آزمایشگاه دیگر آزمایش Diasorin Liaison را بکار بردند.

گرچه آزمایش ها براحتی غلظت های بیش از حد نرمال ۲۵ هیدروکسی ویتامین D را تشخیص می دهند، اندازه گیری غلظت های low-normal , subnormal بسیار مشکل تر است و نیازمند روشهای معتبر عاری از تداخل می باشد.

تحقیقات تضمین کیفیت خارجی و برنامه های آزمایشی تخصصی، تفاوت هایی را در نتایج آزمایشات مختلف اندازه گیری ۲۵– هیدروکسی ویتامین D مثل CLIA , RIA (کمی لومینسانس ایمنواسی) و LC- MS/ MS متوجه شدند.

تفاوت در نتایج، منعکس کننده:

۱- تفاوت در کالیبراسیون آزمایشات

۲- غیر اکی مولار بودن پاسخ های برخی از آزمایشات به ۲۵- هیدروکسی ویتامین D و ۲۵ هیدروکسی ویتامین D₃

۳- مواد غیر قابل تبدیل و تغییر بکار رفته در تحقیقات

پاسخ های غیراکی مولار در بین روش های اتوماسیونی و خودکار رایج و معمول است اما در آزمایش LC- MS / MS و HPLC نه.

باید دقت  و مراقبت در نتایج تفسیر شده از تحقیقات تضمین کیفیت خارجی و برنامه های آزمایشی تخصصی در نظر گرفته شود. مواد تحقیقاتی که به طور گسترده تهیه شده اند غیر قابل تغییر و تبدیل هستند و باعث افزایش تغییر پذیری آزمایش ها می شوند. علاوه بر آن، مواد تحقیقاتی که نقص ۲۵ هیدروکسی ویتامین D₂ دارند، هیچ نشانه ای از آزمایش که تحت بازیابی آن باشد، ندارند.

برای رسیدگی به این نگرانی ها، یک تحقیق به وسیله ی College of American Pathologists آماده شد. ۵ مجموعه از سرم انسانی که به میزان حداقل فرآوری شده جهت پوشش دادن رنج غلظت های ۲۵ هیدروکسی ویتامین D از حدود ۱۵ تا ۶۰ ng/ml آماده شد. دو تا از مجموعه ها حاوی غلظت های افزایش یافته ی ۲۵ هیدروکسی ویتامین D₂ بود؛ این نمونه ها از سرم افراد داوطلبی که ۲۵ هیدروکسی ویتامین D₂ مصرف کرده بودند بدست آمد نه از طریق افزودن ۲۵ هیدروکسی ویتامین D₂ به سرم ها.

مقدارهای هدف به وسیله ی آزمایش LC-MS/MS  در آزمایشگاه مرجع در CDC تعیین شدند. این تحقیق نشان داد که بعضی آزمایشات، به میزان کمتری مقدار کل ۲۵ هیدروکسی ویتامین D را در نمونه های با ۲۵ هیدروکسی ویتامین D افزایش یافته برآورد و حساب می کنند، اما خطای فاحش ۱۰۰% یا بیشتر دیده شده در آزمایشات قبلی وجود نداشت.

آزمایشگاههای متفاوت که LC-MS/MS  را بکار می برند با آزمایشگاههایی که آزمایش های تجاری منفرد به کار می برند با وجود تفاوتهایی که میان آزمایشهای LC- MS/MS می باشد، مقایسه شدند.

علی رغم بهبود نتایج کلی، حتی با معیار پذیرش و قبول بالا که اجازه ی وجود این تفاوت ها را از معیار هدف به میزان ۲۵% می دهد،  نرخ عبور کلی از این معیار در ۵ مجموعه افراد ۸۳% تا ۹۲% بود.

امید هست که تلاش در زمینه NIST و در جاهای دیگر منجر به بهبود دقت آزمایش ها گردد.

رادیو ایمنواسی و کمی لومینسانس ایمنواسی

گسترش آنتی سرم مفید، اجازه گسترش رادیوایمنواسی رقابتی (RIA) برای ۲۵ هیدروکسی ویتامین D را می دهد.

آنتی سرم بر علیه آلبومین سرم گاوی کونژوگه شده به آنالوگ ویتامین D فاقد زنجیره جانبی (۲۳، ۲۴، ۲۵، ۲۶، ۲۷، پنتانور ویتامین D –C (22) کربوکسیلیک اسید) . یک آنالوگ Radioiodinated VitD (3- آمینوپروپیل مشتق شده از ویتامین C-D (22) – آمید) به عنوان ردیاب استفاده شد.

نمونه ها و کالیبراتورها با استونیتریل دپروتئینه می شوند و مستقیماً بدون کروماتوگرافی آنالیز می شوند. گرچه آنتی سرم، ۲۴ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D و ۲۶ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D و ۲۵ هیدروکسی ویتامین D – ۲۳ و ۲۶ لاکتون نیز تشخیص داده می شوند، نتایج ۲۵ هیدروکسی ویتامین D بدست آمده قابل مقایسه با آن هایی که با روش HPLC بدست آمده اند است که به دلیل غلظت های بسیار کمتر دیگر متابولیت ها می باشد. RIA  به میزان بسیار کمتری به مواد و ترکیبات مداخله کننده ی سرم در مقایسه با CPBA که از DBP استفاده می کند، حساس است. این آزمایش به طور تجاری به عنوان یک RIA و به عنوان یک روش ایمنواسی اتوماسیونی و خودکار مبنی بر ردیابی کمی لومینانس (CLIA) در دسترس است.

Manufacturer (تولید کارخانه ای) جایگزین آنتی سرم اوریجینال RIA در اواخر دهه ۱۹۹۰ شده است.

آزمایش های ایمنواسی برای ۲۵ هیدروکسی ویتامین D از چندین manufacturers بدست آمده و تظاهر پیدا کرده است . برخی از این آزمایشات،  غلظت کلی ۲۵ هیدروکسی ویتامین D را هنگامیکه ۲۵ هیدروکسی ویتامین D₂ حضور دارد کمتر تخمین و برآورد می کنند. این یک نگرانی خاص در امریکا به دلیل در دسترس بودن مکمل های با دوز بالای ویتامین D₂ است.

آزمایش های رقابتی Protein Binding همراه با پروتئین باند شونده ویتامین D

قبل از گسترش آزمایشات ایمنواسی، ۲۵ هیدروکسی ویتامین D در ابتدا به وسیله  CPBA همراه با DBP به عنوان یک متصل شونده اختصاصی و همراه با tritiated 25 هیدروکسی ویتامین D₃ (100ci/mmol >) به عنوان یک ردیاب اندازه گیری می شد.

آزمایشات براساسDBP هر دو میزان ۲۵ هیدروکسی ویتامین D₂ و ۲۵ هیدروکسی ویتامین D₃ را اندازه گیری می کنند اما بررسی اینکه آن ها به یک میزان نسبت به۲۵ هیدروکسی ویتامین D₂ و۲۵ هیدروکسی ویتامین D₃ پاسخ می دهند بسیار مهم است.

اگر روند آزمایش شامل مرحله کروماتوگرافی جهت ایزولاسیون ۲۵ هیدروکسی ویتامین D نباشد، دیگر متابولیت ها مانند ۲۵ هیدروکسی ویتامین D₃ – ۲۳ و ۲۶ لاکتون، ۲۴ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D ، ۲۵ و ۲۶ دی هیدروکسی ویتامین D و به میزان خیلی کمتر، ویتامین D نیز اندازه گیری می شوند؛ بنابراین غلظت ۲۵ هیدروکسی ویتامین D به میزان حدود ۱۰% در افراد سالم بیشتر تخمین و برآورد می شود. غلظت های ۲۵ هیدروکسی ویتامین D به طور قابل توجهی هنگامیکه به وسیله ی CPBA اندازه گیری شود نسبت به وقتیکه به وسیله RIA یا HPLC اندازه گیری شود بیشتر گزارش می شود.

HPLC و جذب UV

روش HPLC برای اندازه گیری ۲۵ هیدروکسی ویتامین D یک فاز نرمال کروماتوگرافی برروی سیلیکا، فاز معکوس کروماتوگرافی برروی C₁₈–  سیلیکا و یا ترکیبی از دو مورد فوق را به وسیله کمی سازی با جذب UV در طول موج ۲۵۴ – ۲۶۵ نانومتر به کار می برد. بیشتر و اکثر روش ها نیازمند هر دوپروسه استخراج و کروماتوگرافی مقدماتی قبل از HPLC هستند. روش های بدون کروماتوگرافی مقدماتی HPLC فاز معکوس ایزوکراتیک یا گرادیانت همراه با ردیابی UV Photodiode- array استفاده می کنند. یک نمونه با حجم ۰٫۵ تا ۱ ml بدلیل محدودیت حساسیت ردیابی با UV نیازمند است . روش هایHPLC  امکان تفکیک ۲۵ هیدروکسی ویتامین D₂ و ۲۵ هیدروکسی ویتامین D₃را نیز می دهد. دقت روش های ایمنواسی و CPBAs بسیار سودمند است.

آزمایش LC-MS/MS

کروماتوگرافی مایع جفت شده با اسپکترومتری مس پشت سر هم ( tandem mass spectrometry ) به طور گسترده ای در اندازه گیری ۲۵ هیدروکسی ویتامین D به کار گرفته می شود. روش های LC- MS/MS در آزمایشگاههای با روزانه ۱۰۰۰ مورد دارای توان عملیاتی نسبتاً بالایی است. روش LC-MS/MS برای اندازه گیری ۲۵ هیدروکسی ویتامین D به عنوان یک ابزار، بسیار جذاب تر شده و به طور گسترده ای در آزمایشگاههای بالینی در دسترس است.

علی رغم قدرت انتخابی بالای روش mass spectrometry ،اپی مر C₃ ترکیب ۲۵ هیدروکسی ویتامین D از ۲۵ هیدروکسی ویتامین D به دلیل اینک دارای جرم یکسان است متفاوت و متمایز نیست.

بنابراین جز اینکه اپی مر، کروماتوگرافی مقدماتی را در برابر کمی سازی mass- spectrometric  جدا کرده است، نتایج آزمایش های LC-MS/MS به وسیله ی C₃اپی مر افزایش یافته اند. این موضوع به دلیل حضور معمول اپی مر در غلظت های  پایئن ندرتاً در افراد بالغ یک مشکل محسوب می شود اما این یک مشکل در کودکان بیمار زیر یکسال می باشد. در آزمایش های LC-MS/MS ، نمونه ها به طور معمول به وسیله افزودن الکل (مثل مخلوط متانول – پروپانول) حاوی یک ایزوتوپ پایدار لیبل شده با استانداردهای داخلی مثل D₃ (oH) 25 (H₆)              hexadeutero 25 hydroxycholecalciferol ) 26 , 26, 26, 27, 27, 27) دناتوره می شوند. به دنبال استخراج ،خشک کردن و باز سازی و باز آرایی در محلول، ۲۵ – هیدروکسی ویتامین D به وسیله مانیتورینگ چندین واکنش، کروماتوگرافی و آنالیز می شود.

متابولیت های ۲۵ هیدروکسی وابسته به D₂ و D₃ به طور جداگانه بوسیله ی LC-MS/MS اندازه گیری می شوند که ممکنه در بعضی شرایط دارای محدویت های بالینی باشند، اما موضوع مهم، گزارش مجموع دو غلظت ۲۵ هیدروکسی ویتامین D₂ و ۲۵ هیدروکسی ویتامین D₃ می باشد زیرا وضعیت ویتامین D به غلظت کل وابسته است، نه به غلظت های منفردهر کدام. جهت دستیابی به گزارش صحیح، بدست آوردن غلظت های هر دو فرم نیاز است اما برای هر دو باید رنج مرجع هم فراهم شود.

اندازه گیری ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D

۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D تقریباً به میزان  غلظت ۲۵- هیدروکسی ویتامین D ، و در غلظت قابل توجه پائین نسبت به سایر متابولیت های  هیدروکسیکه در خون گردش می کند.  در حقیقت در کنار غلظت آن ، ناپایداری و هیدروفویسیته (آبگریزی) این ترکیب به میزان زیادی تعیین و اندازه گیری آن را در سرم پیچیده و دشوار کرده است. گسترده ترین روشهای بکاررفته نیازمند استخراج ، کروماتوگرافی وکوآنتیفیکاسیون (کمی سازی) به وسیله ی (RRA) Radio Receptor Assay می باشد.

(RRA) Radio Receptor Assay

آزمایشاتی مبنی بر استفاده از رسپتورهای ویتامین D بدست آمده از تیموس گوساله ویا روده جوجه ، گزارش شده است اما به ندرت در آزمایشگاههای بالینی به کاررفته است. جزئیات مربوطه در نسخه قبلی این کتاب وجود دارد.

رادیو ایمنواسی( RIA )

اولین رادیوایمنواسی برای اندازه گیری ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D در سال ۱۹۷۸ معرفی شد و نیازمند خالص سازی سنگین و سخت است. بعد از چندین آزمایش با شاخص های مشابه، در سال ۱۹۹۶ نوع دیگری از RIA همراه با گزارشگر یددار و به کاربردن ماتریکس اکی والانت سرم، معرفی شد. برای این روش، خالص سازی نمونه نیازی نیست.

روش RIA بسیار راحت تر از روش RRA برای ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D است زیرا یک ردیاب یددار رادیواکتیو، نیاز به انعکاس مایع را حذف می کند و آنتی سرم هم نیاز به فراهم کردن VDR از تیموس گوساله را حذف می کند.

RIA یک آنتی سرم با ۱ تا ۲ درصد واکنش متقاطع با مقدار بیشتر متابولیت های ویتامین D غیر ۱- هیدروکسیله شده و یک ردیاب لیبل شده با  ید (I) آماده شده از ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی – ۲۴ و۲۵ و ۲۶و ۲۷ تترانور – (۲۳) C کربوکسیلیک اسید و Bolton Hunter لیبل شده با مواد رادیو اکتیو، به کار می برد.

پیش از آنالیز، نمونه ها همراه با استونیتریل دپروتئینه می شوند، به وسیله متاپریودیت سدیم اکسیده می شوند و به وسیله ی C₁₈ – oH و کارتریج سیلیکا خالص می شوند. سدیم متاپریودیت جهت حذف تداخل ۲۴ و ۲۴ دی هیدروکسی ویتامین D و ۲۶ و ۲۵ دی هیدروکسی ویتامین D به وسیله ی اکسید اسیون آن ها به فرم های آلدهیدی و کتونی شان که به راحتی به وسیله ی کروماتوگرافی جدا می شوند، ضروری و لازم است.

یک ستون سیلیکا به کارتریج C₁₈ – Oh منفرد به کار رفته با رادیو رسپتوراسی (RRA) جهت کاهش تداخل در RIA اضافه شد. با این RIA، پتانسیل ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D₂ به میزان حدود %۷۰ پتانسیل ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D₃ می باشد.

بهبود نمونه های افراد تعیین نشده است گرچه کالیبراتورها در یک سرم  strip شده و به طور یکسان به نمونه ها تیمار شدند.

این روش با تعداد زیادی از متابولیت های ۱- هیدروکسیله شده شامل ۲۵ و ۲۴ و ۱ تری هیدروکسی ویتامین D ، ۲۶ و ۲۵ و ۱ تری هیدروکسی ویتامین D و ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D 23 و ۲۶ لاکتون به میزان %۲۵- ۱۳ واکنش متقاطع دارد.

۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D- 23 و ۲۶ لاکتون یک متابولیت مهم که غلظت آن %۳۰- ۰ غلظت ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D₃ است. اصلاح این روش با بکار بردن یک کارتریج بسیار تمیز (extra clean) C₁₈ – oH  به طور تجاری در دسترس است. روش RIA دردسترس تجاری دیگری گسترش یافته است که استخراج ایمنی انتخابی ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D را به کار می برد. گزارش شده است که این روش دارای واکنش متقاطع بیشتر با متابولیت های ۱- هیدروکسیله شده شامل ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D₃– 23 و ۲۶ لاکتون و کلسی پوتریول است که برای درمان پوریازیس استفاده می شود.

غلظت های ظاهری ۲۵ و ۱  دی هیدروکسی ویتامین D به طور قابل توجهی با این روش نسبت به روش RRA در بیماران با هیپوپاراتیروئیدیسم دریافت کننده درمان با ویتامینD ، بیماران با انسداد مجرای صفراوی و در بعضی نمونه های نرمال، بالاست.

عیب یابی آزمایش های اندازه گیری  Vitamin D

روش های نیازمند استخراج و کروماتوگرافی جهت بهبود اندازه گیری متابولیت های ویتامین D مورد نظر و برای حلال یا ستون های شاهد باید مانیتور شوند. بررسی تضمین اینکه متابولیت های D₂ و D₃ به میزان مساوی و برابر بهبود یافتند، با فراهم کردن یک اندازه گیری کلی ۲۵ هیدروکسی ویتامین D یا ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D ، باید انجام شود.

حلال ها، مواد کروماتوگرافی و کارتریج ها ممکنه دارای موادی باشند که با کوآنتیفیکاسیون (Quantification) متابولیت های ویتامین D به وسیله ی CPBA ، RIA و RRA یا جذب UV بعد از HPLC تداخل می دهند که موجب اندازه گیری بیشترمتابولیت های ویتامین D می شود.

هر نوع تداخلی می تواند به وسیله ی تیمار یک آب شاهد به طور یکسان با نمونه ها، مانیتور شود.

غلظت های غیر قابل ردیابی و غیر قابل اندازه گیری ویتامین D در این شاهد( blank ) ، عدم حضور تداخلات مثبت را بررسی می کند. کالیبراتورهای آزمایش های ویتامین D باید از محلولهای  Stock ای که غلظت و خلوص شان به وسیله ی اسپکتروفوتومتری چک شده است، آماه شود. محلولهای  Stock در صورتیکه نرخ جذبشان از ۲۶۴ نانومتر تا ۲۲۸ نانومتر مساوی یا بیشتر از ۵/۱ باشد، مناسب هستند. محلول های stock با بکار بردن یک ضریب انهدام (extinction) به میزان l/mol/cm 200/18 برای متابولیت های ویتامین D3 در طول موج ۲۶۴ نانومتر تعدیل و تنظیم می شود.

ردیاب ها برای بهبود و بازیابی دقیق باید خالص باشند. هم کالیبراتورها و هم ردیاب ها ممکنه به وسیله ی HPLC خالص شوند.

نیازمندی های نمونه

سرم به طور معمول برای اندازه گیری متابولیت های ویتامین D به کار می رود، گر چه پلاسما به طور معمول برای آزمایشهایی که در آن استخراج و کروماتوگرافی استفاده می شود، قابل قبول و پذیرش است.

سرم جدا شده از لخته نسبتاً هم در درجه حرارت اتاق و هم در C  ° ۴  پایدار است. اگر قرار باشد آنالیز نمونه ها با تأخیر انجام شود باید فریز شوند. متابولیت های ویتامین D در سرم یا پلاسما به نظر نمی رسد نسبت به نور حساس باشند و نیازمند کنترل های خاص در آزمایشگاه نیستند.

رنج نرمال و مرجع

رنج نرمال و مرجع برای متابولیت های ویتامین D وابسته به روش هستند. یک نماینده و نشانگر یک برای ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D عبارتند از :

                                                                                                          Pg/ml          ۱۵ – ۶۰  : D ₂(oH)25 و ۱

                                                                                                                    ۳۶-۱۴۴ pmol/l

حدهای پائین تر رنج نرمال برای ۲۵ هیدروکسی ویتامین D   ng/ml 15-10 (nmol/l 37- 25) به طور فزاینده ای به دلیل پائین بودن نامناسب انتقاد شده اند. حتی بالاتر بودن از این حد ویتامین D افراد می تواند نامناسب باشد.  (جدول ۵-۵۲)

غلظت های کمتر از ۳۰-۲۰ ng/ml  یا nmol/L 50-75 می تواند با افزایش غلظت های PTH سرم و کاهش جذب کلسیم مرتبط باشد. در اواخر سال ۲۰۱۰ ، موسسه امریکایی پزشکی یک توصیه برای حد پائین تر برای کافی بودن ویتامین D از ۳۰ به ۲۰ ng/ml توصیه کرد و بیان کرد که غلظت های بالای ng/ml 50 به عنوان یک نگرانی در نظر گرفته شود.

در سال ۲۰۰۲ و ۲۰۰۳ مطالعه سوم تحقیق آزمایشات و معاینات تغذیه ای و سلامت ملی (NHANES) ، یک شیوع بالای غیر قابل پیش بینی کمبود در ویتامین D در افراد بالغ در شمال امریکا گزارش کرد.

برای مثال، کمبود ویتامین D [ 25 هیدروکسی ویتامین D > 20ng/ml یا ۵۰ng/ml [ به طور گسترده ای در طول زمستان در افراد بالغ (۳۰ سال به بالا) مرد Caucasin (%15) و زنان (% ۳۰) که در جنوب ایالات متحده زندگی می کنند، معمول است. یافته های مشابهی از اروپا گزارش شده است.

غلظت های ۲۵ هیدروکسی ویتامین D در امریکایی افرایقایی تبار ها نسبت به سفیدپوستان غیر Hispanic کمتر است، اما اهمیت بالینی آن نامشخص است. در مقایسه با سفید پوستان غیر Hispanic ، امریکایی های افریقایی تبار دارای تراکم استخوان ( از لحاظ معدنی)، غلظت های پلاسما بالاتر PTH و ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D ، غلظت های پائین تر مارکرهای بیوشیمیایی بازسازی استخوان و نرخ های پائین تر پوکی استخوان بیشتری هستند.

غلظت های در گردش ۲۵ هیدروکسی ویتامین D به وسیله ی در معرض آفتاب افزایش می یابند وبا تغییر فصل بالاترین غلظت در تابستان یا پاییز و پائین ترین غلظت در زمستان و بهار می باشد. این منجر به این شده است که آزمایش در پایان زمستان انجام شود ، اگر نتایج بالای cutoff باشند، احتمالاً بیمار غلظت های کافی از ویتامین D در سرتاسر سال در رژیم غذایی و یا در معرض آفتاب بودن یا مصرف مکمل ویتامین D داشته است.

غلظت ها به وسیله ی عرض جغرافیایی ، استفاده از کرم های ضد آفتاب و رنگ پوست تحت تأثیر قرار می گیرند.

غلظت های ng/ml 100 (nmol/l 250)  ۲۵ هیدورکسی ویتامین D سرم در افرادی که به میزان زیادی در معرض نورخورشید هستند مثل غریق نجات ها غیر معمول نیست.

غلظت های متابولیت های ویتامین  D باسن تغییر میکند و در حاملگی افزایش می یابد. غلظت های ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D در حاملگی و در بچه ها نسبت به افراد بالغ بالاتر است ) بالاترین غلظت ها( .گرچه گزارش شده است که غلظت های ۲۵ هیدروکسی ویتامین D و ۲۵ و ۱ دی هیدروکسی ویتامین D با سن کاهش می یابد، این کاهش می تواند نتیجه تغذیه ضعیف و نا مناسب، کاهش مجاورت با نور خورشید و کاهش وضعیت سلامت بدن باشد.

در مطالعات محدود شده به افراد فعال و سالم، غلظت های این متابولیت ها با سن تغییر نکرده اند.

 FOODA.IR

بازدیدها: 10