لاکتو پراکسیداز

لاکتوپراکسیداز آنزیمی است که انتقال اکسیژن را از پراکسید ها (به ویژه پراکسید هیدروژن) به سایر ترکیبات کاتالیز می کند که در نتیجه پراکسیدها را تجزیه کرده و اکسیژن فعال یا اتمی تولید می نماید.پراکسیداز شیر لاکتوپراکسیداز نامیده می شود و همه شیر ها دارای این آنزیم هستند.اگرچه مقدار پراکسیداز شیر تا حدی متغیر است ولی شیر به عنوان یکی از بهترین منابع آن شناخته می شود.فرایند پاستوریزاسیون را تحمل کرده ولی در برخی کشورها جهت کنترل رسمی پاستوریزاسیون سریع مورد استفاده قرار می گیرد.

در صورت حرارت دادن شیر در ۸۳ درجه به مدت ۱۵ ثانیه تست پراکسیداز جواب منفی خواهد دادولی این آنزیم پس از یک تا دو روز مجددا فعال خواهد شد.چنانچه بخواهیم پس از این مدت جواب منفی به دست آوریم باید شیر را به مدت ۱۵ ثانیه حداقل ۸۸ تا ۹۰ درجه حرارت دهیم.
یک گلیکوپروتئین است که حاوی گروه هم (به عنوان گروه پروستاتیک)با حدود ۰٫۰۷ %آهن می باشد که باعث شده است این آنزیم دارای فعالیت غیرآنزیمی نیز باشد.در نتیجه این آنزیم قادر است اسیدهای چرب غیر اشباع را اکسید نموده و ترکیبات آزادی تولید کند که در ایجاد طعم اکسیدی در فراورده های لبنی دخیل هستند.

نقش مهمتری که این آنزیم دارد توانایی در جلوگیری از رشد باکتری های گرم مثبت و منفی در حضور H2o2 و تیوسیانات می باشد.فعالیت این آنزیم همراه با هیدروژن پراکسید و تیوسیانات هر دو در غلظت mM0.25 ماندگاری شیرخام را در ۱۰ درجه تا ۳ روز افزایش می دهد.محافظت شیر پاستوریزه HTST ،کاهش تعداد باکتری ها(اکسیداسیون گروه SH در غشای سیتوپلاسمی باکتری)در طی نگهداری،استفاده در تهیه محلول های آرایشی و چشمی و تیمار های زخم و دندان، ضد تومور از دیگر کاربرد های این آنزیم است.

جمع‌آوری و انتقال شیرخام به کارخانه یکی از نقاط بحرانی در چرخه تولید محسوب می‌شود. برای متوقف کردن یا به تاخیر انداختن افت و فساد شیر طی حمل آن از دامداری به کارخانه، سرد کردن شیر صورت می‌گیرد. به سبب هزینه‌های بالای عملیات و کمبود سرمایه، مشکلات مربوط به تعمیر تجهیزات، کمبود انرژی الکتریکی و عدم وجود جاده های مناسب، این امر به ویژه در کشورهای در حال توسعه با مشکلاتی همراه است. به علاوه دمای بالا در برخی از این مناطق اغلب به عنوان یکی از مشکلات جمع‌آوری شیر محسوب می‌گردد. در بسیاری از مناطق شیر دوشیده شده در عصر با شير دوشيده شده در صبح روز بعد، تحويل كارخانه مي‌گردد، اين امر در مناطق گرم باعث فساد شير دوشيده شده در عصر مي‌شود. جهت حل این مشکل روشی توسط IDF و FAO ارائه شد در این روش فعال‌سازی سیستم ضد میکروبی لاکتوپراکسیداز که به صورت طبیعی در شیر وجود دارد؛ مطرح گردید. سیستم مذکور با افزایش دو ترکیب فعال کننده تیوسیانات و پراکسید هیدروژن فعال می‌شود و طی این فرایند ترکیبات ضدمیکروبی حاصل می‌شود. سیستم لاکتوپراکسیداز شامل سه بخش لاکتوپراکسیداز، تیوسیانات و پراکسید هیدروژن است و تنها در حضور هر سه عامل این سیستم فعال می‌گردد.

لاکتوپراکسیداز ، تیوسیانات را در حضور پراکسید هیدروژن اکسید می‌کند و به این ترتیب هیپو تیوسیانات با خاصیت ضد میکروبی قوی تولید می‌گردد. این ترکیب با SH پروتئین‌های باکتریایی پیوند برقرار کرده و اثر بازدارندگی خود را بر ویروس ها، قارچ‌ها و باکتری ها اعمال می‌نماید. همانگونه که پیش‌تر نیز اشاره شد پراکسید هیدروژن به منظور فعال شدن این سیستم نیاز است. به صورت طبیعی برخی از انواع میکروارگانیسم‌ها نظیر لاکتوباسیلوس‌ها و استرپتوکوکوس‌ها تحت شرایط هوازی پراکسید هیدروژن تولید می‌کنند و به این ترتیب به فعال شدن این سیستم منتهی می‌گردد.

لاکتوپراکسیداز پلی پپتیدی با ۶۱۲ اسید آمینه است و وزن ملکولی معادل ۷۸ کیلو دالتون دارد و نقطه ایزو الکتریک آن برابر ۹/۶ می‌باشد. لاکتوپراکسیداز یک گلیکوپروتئین است که حداقل ۱۰ فراکشن آن شناخته شده است که از نظر فعالیت آنزیمی تفاوت چندانی با هم ندارند. لاکتوپراکسیداز دارای یک گروه هم (آهن)و حدود ۱۰ درصد کربوهیدرات است و دارای۰۷ /۰ درصد آهن است. لاکتوپراکسیداز در طول موج ۴۱۲ نانومتر حداکثر جذب را دارد و از آنزیم های مقاوم به حرارت است که به عنوان شاخص پاستوریزاسیون محسوب می شود.

میزان لاکتوپراکسیداز در شیر

غلظت لاکتوپراکسیداز در شير آغوز (کلستروم) بر خلاف سایر پروتئینهای ضد میکروبی پایین است و پس از سه تا ۵ روز بعد از وضع حمل به سرعت افزایش می‌یابد. میزان این آنزیم به عوامل مختلفی نظیر دوره فعاليت جنسی، فصل، رژیم غذایی و نژاد دام وابسته است. شیر گاو حاوی ۱/۲ تا ۱۹/۴ واحد در میلی لیتر لاکتوپراکسیداز است و در حدود ۲۰ برابر بیشتر از شیر انسان دارای فعالیت پراکسیداز است. گزارش اخیر نشان می‌دهد میانگین فعالیت لاکتوپراکسیداز در شیر گاو بین ۱/۵ تا ۲/۷ واحد در میلی‌لیتر و میانگین آن معادل ۲/۳ واحد در میلی‌لیتر است. در سال ۱۹۸۵ Reiter میزان کمتری از لاکتوپراکسیداز یعنی ۱/۴۲ واحد در میلی‌لیتر را در شیر گزارش کرد.

یون تیوسیانات

این یون در غدد پستانی، بزاق دهان و غده تیروئید و ترشحات آنها وجود دارد. در شیر گاو بین ppm 1 تا ۱۵ گزارش شده است.

پراکسید هیدروژن

پراکسید هیدرژن سومین بخش سیستم لاکتوپراکسیداز محسوب می‌شود. بسیاری از لاکتوباسیل‌ها، لاکتوکوکوس‌ها و استرپتوکوکوس در شرایط هوازی تولید پراکسید هیدروژن می‌کند که منجر به فعال شدن سیستم لاکتوپراکسیداز می‌گردد. پراکسید هیدروژن ممکن به شیر اضافه شود یا توسط موادی نظیر سدیم پرکربنات گلوکز تولید ‌گردد. پراکسید هیدروژن تنها افزودنی تایید شده در حفظ و نگهداری شیر در شرایط نگهداری غیر یخچالی است. پراکسید هیدروژن را می‌توان به میزان ۱۰۰ تا ۸۰۰ میلی گرم در لیتر به شیر افزود. پراکسید هیدروژن برای سلول های پستانداران به شدت سمی می‌باشد. به هرحال در مقادیر کمتر از ۱۰۰ میکرو مول یا کمتر و در حضور لاکتوپراکسیداز و تیوسیانات سمی نمی‌باشد.

مکانیسم عمل واکنش سیستم لاکتوپراکسیداز

میزان لاکتوپراکسیداز مورد نیاز جهت فعال شدن این سیستمppm 0/5 تا ۱ است؛ این در حالی است که شیر گاو به طور طبیعی دارای ppm 30 لاکتوپراکسیداز است و بنابراین میزان این آنزیم در حالت طبیعی به منظور فعال نمودن این سیستم به حد کفایت می‌باشد. تیوسیانات و پراکسید هیدروژن نیز در شیر وجود دارند در مورد پراکسید هیدروژن حد مورد نیاز فعال سازی سیستم مذکور ۱۰۰ واحد بین‌المللی در میلی‌لیتر است؛ در حالی که به طور معمول ۱ تا ۲ واحد بین‌المللی در میلی لیتر از این ماده در شیر وجود دارد. میزان تیوسیانات موثر نیز ۰/۲۵ میلی مول است در صورتیکه در شیر بین ۰/۲ تا ۰/۲۵ میلی مول از ترکیب موجود است. بنابراین با افزودن ۰/۲۵ میلی مول (ppm 12) تیوسیانات و ۰/۲۵ میلی مول (ppm 8) پراکسید هیدروژن این سیستم فعال می‌شود و تا ۵ روز می‌توان شیر را نگهداری نمود. عملكرد این سیستم در دمای ۳۰ درجه سانتی‌گراد موثرتر از ۵ درجه سانتی‌گراد است.

روش فعالسازی سیستم لاکتوپراکسیداز

یون تیوسیانات به شکل نمک سدیم و پتاسیم در حدود ۱۴ میلی‌گرم در لیتر به شیر اضافه می‌شود و به عنوان سوبسترا سیستم لاکتوپراکسیداز به شمار می‌آید. پراکسید هیدروژن به میزان ۱ تا ۱۰ میلی‌گرم در لیتر باید به شیر افزوده شود. پراکسید هیدروژن ترکیب ناپایداری است و با پروتئین‌ها نیز برهمکنش داشته و به این ترتیب در این غلظت مشکلاتی را در فرآوری فرآورده‌های شیری ایجاد می‌کند. بنابراین کدکس استفاده از پرکربنات سدیم را به عنوان منبع تامین کننده یون پراکسید به میزان ۳۰ میلی گرم در لیتر توصیه می‌کند.

امروزه می‌توان از کیت‌های ویژه‌ای شامل تیوسیانات و پرکربنات استفاده نمود. اغلب این کیت‌ها برای تیمار ۵۰ لیتر شیر طراحی شده‌اند و البته لازم به ذکر است کیت‌هایی برای تیمار ۵۰۰ تا ۱۰۰۰۰ لیتر شیر نیز به صورت تجاری در دسترس می‌باشند. مشکلات عمده‌ای که در رابطه با این مواد وجود دارد به شرح زیر است:

Ÿ تیوسیانات یک ترکیب هیگروسکوپیک (نم گير) بوده و ممکن در طی زمان تخریب گردد؛ اگر چه می توان با استفاده از پوششهای غیر قابل نفوذ بر این مشکل فائق آمد.

Ÿ برخی از منابع تیوسیانات از استانداردهای کیفی مورد قبول برخوردار نیستند.

Ÿ پرکربنات می‌تواند با تولید اکسیژن منجر به باد کردگی بسته‌های مورد استفاده برای نگهداری آنها گردد.

اثر ضد میکروبی آنزیم لاکتوپراکسیداز

ارگانیسم‌های گرم منفی و کاتالاز مثبت نظیر سودوموناس، کلی فرمها، سالمونلا، شیگلا نه تنها سیستم لاکتوپراکسیداز مانع فعالیت آنها می‌شود بلکه تحت شرایط محیطی (شرایط دما، زمان انکوباسیون ، pH، دانسیته سلولی) حتی آنها را نابود نمابد. سیستم لاکتوپراکسیداز جلوی فعالیت باکتریهای کاتالاز منفی و گرم مثبت نظیر استرپتوکوکوک و لاکتوباسیل را می‌گیرد اما قادر به كشتن آنها نيست. این تفاوت در حساسیت نسبت به سیستم لاکتوپراکسیداز احتمالا ناشی از تفاوت در ساختار دیواره سلولی و تفاوت در خصوصیت نفوذ پذیری آنهاست. غشای داخلی باکتریهای گرم منفی بیش از انواع گرم مثبت توسط سیستم لاکتوپراکسیداز آسیب می‌بیند.

لاکتوپراکسیداز SCN – را در حضور پراکسید هیدروژن به ترکیب ناپایدار هیپوتیوسیانات مبدل می‌کند که برای ميكروارگانيسم‌هاي بيماري‌زاي روده‌ای نظیر گونه‌های مقاوم به آنتی بیوتیک اشرشیاکلی دارای خاصیت باکتری‌کش می‌باشند.

استافيلوكوكوس اورئوس به عنوان عامل اصلی بروز بیماری ورم پستان، می‌تواند به شیر منتقل گردد . گرچه این میکروارگانیسم در اثر پاستوریزاسیون از بین می‌رود اما انتروتوکسین حاصل از آن می‌تواند در برابر فرایند پاستوریزاسیون مقاومت کند و عامل بروز مسمومیت غذایی گردد. سیستم لاکتوپراکسیداز در برابر استافيلوكوكوس اورئوس دارای خاصیت باکتری‌کش و باکتریو استاتیک است.

توانایی سیستم لاکتوپراکسیداز در تخریب آفلاتوکسین در حضور کلرید سدیم ۲۲۵ میکرومول و پراکسید هیدروژن به میزان ۵۰ میکرومول گزارش شده است. سیستم لاکتوپراکسیداز در برابر آسپرجیلوس، آلترناریا، پنسیلیوم کریزوژنوم و کلاویسپس دارای خاصیت ضد قارچی است.

استفاده از سیستم لاکتوپراکسیداز برای نگهداری شیر خام

یکی از مهمترین کاربردهای سیستم لاکتوپراکسیداز در صنعت شیر حفظ شیر خام در طی نگهداری و انتقال آن به کارخانه است. ترکیبات ضد میکروبی حاصل در اثر فعال سازی سیستم لاکتوپراکسیداز جلوی فساد و فعالیت میکروارگانیسم‌های بيماري‌زا را می‌گیرد. فعالیت سیستم لاکتوپراکسیداز در شیر با افزایش SCN – تا غلظت ۲۵/۰ میلی مول و افزودن هیدروژن پراکسید به همان میزان جلوی رشد باکتریهای سایکروتروف(سرماگرا) را به مدت ۵ روز می‌گیرد. اثر باکتری‌کشی این سیستم بر روی اشرشیاکلی زمانیکه SCN – از غلظت ۰۱۵/۰ به ۱۵/۰ میلی مول افزایش می‌یابد تشدید می‌شود و زمانیکه شمار اولیه میکروارگانیسم‌ها افزایش می‌یابد این اثر کاهش می‌یابد و زمانیکه میزان هیدروژن پراکسید و SCN – به میزان ۳/۰ میلی مول می‌رسد اثر باکتری‌کشی این سیستم بر روی سودوموناس فلورسانس تشدید می‌گردد.

زمانیکه شیر در دمای ۳۰ ، ۲۵ ، ۲۰ و ۱۵ درجه سانتی‌گراد قرار می‌گیرد اثر ضدمیکروبی سیستم لاکتوپراکسیداز به ترتیب مدت ۷ تا ۸ ساعت ، ۱۱-۱۲ ، ۱۶-۱۷ و ۲۴-۲۶ ساعت به طول می‌انجامد.

در سال۱۹۹۱محققین دریافتند فعال‌سازی سیستم لاکتوپراکسیداز به همراه استفاده از فرایند پاستوریزاسیون، می‌توان شیر گاو را در ۱۰ درجه سانتی گراد به مدت ۲۰ روز در مقایسه با شیر تیمار نشده نگهداری کرد .آنها دریافتند شیری که در آن سیستم لاکتوپراکسیداز فعال شده طی ۱۲ روز رشد و بقای میکروارگانیسم‌های شیر صورت می‌گیرد و پس از ۲۲ روز شمار میکروارگانیسم ها به ۱۰۳ می‌رسد در حالیکه شیری که در آن سیستم لاکتوپراکسیداز فعال نشده به مدت ۴ روز رشد و بقای میکروارگانیسمها در آن رخ می‌دهد و پس از ۲۲ روز شمار میکروارگانیسم‌ها به۱۰۶ تا ۱۰۷ سلول در میلی لیتر می‌رسد. فعال کردن سیستم لاکتوپراکسیداز با استفاده از ppm 20:20 یا ۶۰:۶۰ SCN – : هیدروژن پراکسید روش موثر در نگهداری شیر در برابر رشد میکروبی در شیر میش و بز در دمای ۲۰ و ۳۰ درجه سانتی گراد به مدت ۶ ساعت محسوب می‌گردد. علاوه بر اهمیت سیستم لاکتوپراکسیداز در نگهداری شیر خام، اين سیستم می‌تواند كيفيت و ماندگاري شیر پاستوریزه با ماندگاری طولانی بهبود بخشد. در اين حالت کیفیت شیر پاستوریزه به سبب کاهش میکروارگانیسم‌های مقاوم به حرارت افزايش می‌یابد.

کاربردهای بالقوه سیستم لاکتوپراکسیداز

یکی از کاربردهای معمول سیستم لاکتوپراکسیداز استفاده از آن در نگهداری شیرخام و یا انتقال به کارخانه است. اما این سیستم از کاربردهای بالقوه دیگری نیز برخوردار است. در صورت استفاده از سیستم لاکتوپراکسیداز قبل از فرایند حرارتی، ماندگاری فراورده‌های لبنی افزایش می‌یابد و میزان حرارت مورد نیاز جهت انجام فرایند کاهش می‌یابد. علاوه بر صرفه‌جویی در انرژی مواد مغذی و کیفیت فراورده‌های لبنی نیز حفظ می‌شود. لیستریا منوسیتوژنس در صورت استفاده از حرارت بلافاصله پس از فعال‌سازی سیستم لاکتوپراکسیداز با سرعت بیشتری نابود می‌شود. سیستم لاکتوپراکسیداز در صورت استفاده از نسبت وزنی مناسب پراکسید هیدروژن، لاکتوپراکسیداز و یون تیوسیانات بر دامنه وسیعی از باکتریها ، مخمرها و کپکها موثر است. نتیجه مناسب زمانی حاصل می‌شود که پراکسیدهیدروژن توسط سیستم آنزیمی گلوکز گلوکز- اکسیداز حاصل شود. از این سیستم می‌توان برای از بین بردن لیستریا منوسیتوجنس از فیله‌های گوشت و ماهی به کاربرد و از رشد سالمونلا تیفی موريوم و اشرشیاکلی در غذای کودک استفاده کرد.

در سال ۱۹۸۵ محققين دریافتند كه با فعالسازی سیستم پراکسیداز ضد میکروبی بزاقی در خمیر دندان می‌توان تولید اسید توسط میکروارگانیسم‌ها را كاهش داد و از تشکیل پلاک دندان و تورم لثه جلوگیری نمود.

References

Yoshida, Sh., YE-XIUYUN. (1991). Isolation of Lactoperoxidase and Lactoferrins from Bovine Milk Acid Whey by Carboxymethyl Cation Exchange Chromatography. J Dairy Sci. 74:1439-1444.

Moeeison, M, Hultquist, D.E. (1963). Lactoperoxidase II. Isolation.

Gaya, P., Media, M., Nunez, M. (1991). Effect of the Lactoperoxidase System on Listeria monocytogenes – Behavior in Raw Milk at Refrigeration Temperatures. Applied and Environmental Microbiology. 3355-3360

Eyassu Seifu, Elna M. Buys and E.F. Donkin. (2005). Significance of the lactoper- oxidase system in the dairy industry and its potential applications: a review. Trends in Food Science & Technology xx 1–۱۸

Jacquot, M., Donato, Ph. De., Barres, O., Pons, M.N., Scher, J., Miclo, A., Poncele, D.(2002). Physicochemical characterisation of the lactoperoxidase system powders: comparison of two drying techniques. Powder Technology 128, 205– ۲۱۲٫

Fox, P.F. and McSweeny, P.L.H. (1998). Dairy Chemistry and Biochemistry

BLACKIE ACADEMIC & PROFESSIONAL An Imprint of Chapman 8 Hall. London Weinheim . New York Tokyo Melbourne . Madras

بازدیدها: 23